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生体液試料からエクソソームを効率的に単離するキット
（SECを用いたエクソソーム単離システム） SmartSEC EV Isolation System

掲載日情報：2021/03/22 現在Webページ番号：69272

システムバイオサイエンス /
System Biosciences, LLC
[メーカー略称：SBI]

様々な生体液試料から簡便にエクソソームなどのEV（Extracellular vesicles、細胞外小胞）を単一のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて単離するキットです。血清・血漿試料などから高純度のEVを簡便、迅速、高収率そして高濃度で単離できます。

ポリマーベースの沈降試薬によりエクソソームを沈殿濃縮する☞ ExoQuick ULTRAシリーズもあります。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

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製品ラインナップ

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品名 ☞ SmartSEC
Mini EV Isolation System		 ☞ SmartSEC
Single EV Isolation System		 ☞ SmartSEC
HT EV Isolation System＊1、＊2
フォーマット

Mini column

Mini column

Single column

Single column

96 well plate

96 well plate
商品コード SSEC100A-1 SSEC200A-1 SSEC096A-1
測定試料 血清、血漿
アポプラスト液、血リンパ		 血清、血漿、CSF（ヒト）
血リンパ（ジャンボアメフラシ）		 血清、血漿
試料量 10～100μl 100～250μl 250～500μl
操作時間 ＜ 30分 ＜ 30分 ＜ 1時間
使用回数 10 reactions 10 reactions 96 reactions
キット内容
  • SmartSEC Mini column
  • Collection tube
  • SmartSEC Mini isolation buffer
  • SmartSEC Single culumn
  • Column buffer
  • SmartSEC HT isolation plate＊3
  • SmartSEC isolation buffer
  • SmartSEC HT collection plate＊3

＊1 キットにはコレクションチューブは含まれていません。別途ご用意下さい。
＊2 8 reactionsの☞ 有償サンプル品をご用意しています。1研究室に1回限りご購入いただけます。
＊3 フィルターおよびプレートは、手動操作およびANSI/SBS規格の自動分注システムの両方に適応しています。


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特長

  • 血清、血漿、または他の生体液から簡便、迅速にEVを単離できます。
  • 単離したEVは、質量分析（MS）、ウエスタンブロッティング、ナノ粒子トラッキング解析（NTA）、透過型電子顕微鏡（TEM）、およびRNAシークエンシング（NGS）などに使用できます。

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SmartSECの利点について

SmartSECは、サイズ排除モードとアフィニティ相互作用モードの2つの機能を備えた新世代の混合モード・クロマトグラフィーです。この2つのモードを1つの樹脂ビーズ中で組み合わせることにより、従来のSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）のような時間と労力のかかるプロセスを必要としません。SmartSECでは、多孔質ビーズの内側のコアがアフィニティ相互作用モードの機能を有しており、IgGやアルブミンなどの400 kDa（15～20 nm）までのタンパク質不純物を捕捉・保持することができます（図1参照）。ビーズの外側のシェルは不活性なため、非特異的な結合を最小限に抑えることができます。


SmartSEC原理

ビーズコアに入り込んだ低分子タンパク質は捕捉されて留まり、EVは排除されて溶出液に回収される。


SmartSECは、組織培養液から血清や血漿まで、様々な溶液中の不純物に対して、優れた結合能を発揮します。従来のSECでは低濃度のフラクションを複数集める必要があるのに対し、SmartSECカラムは、高濃度のEVを1つのフラクションとして溶出できるように最適化されています（図2参照）。SmartSECシステムの有用性を最大限に引き出すために、 3つのフォーマットで製品化して、幅広い試料タイプに対するニーズに応えました。


SmartSEC操作方法

図2. SmartSECによるEV分離ワークフローの模式図

プレウォッシュしたSmartSECビーズのカラムへ、血清や血漿などの生体液試料を十分な量の分離用バッファーと共にロードし、室温で30分間、十分に混合・結合させます。インキュベーション後、500×gで1分間遠心分離し、分離されたEVを回収します。溶出したEVは、直ちに下流のあらゆるアプリケーションに使用できます。

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SmartSEC Mini EV Isolation System（#SSEC100A-1）

血清試料から発生生物学のモデル動物由来試料まで、少量（10μl～）の生体液試料からエクソソームなどのEV（Extracellular vesicles、細胞外小胞）をSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）により単離するキットです。わずか10～100μlの試料から約30分間で高品質のEVを単離できます。

SmartSEC Mini EV Isolation Systemの使用例

キイロショウジョウバエの血リンパから精製したEVのウエスタンブロット分析例

キイロショウジョウバエ血リンパから精製したEVのウエスタンブロット分析

本製品を用いてキイロショウジョウバエの血リンパ10μlからEVを精製し、その1μgタンパク質相当量を図の左に記載のショウジョウバエの一般的なエクソソームマーカーを用いてウエスタンブロッティングで分析した。
Dr. Karen Linnemannstöns, University of Göttingen提供

プラナリアとシロイヌナズナからのEVの単離例

プラナリア新生細胞培養液からのEVの単離例

プラナリアからのEVの単離例
本製品を用いてプラナリア新生芽細胞の培養液100μlから単離したEVのTEM（透過型顕微鏡）像
Dr. Vidyanand Sasidharan, Stowers Institute for Medical Research提供

プラナリアからのEVの単離例

シロイヌナズナからのEVの単離例
本製品を用いてシロイヌナズナのアポプラスト液50μlから単離したEVのTEM（透過型顕微鏡）像
Dr. Claudia Uhde-Stone, California State University, East Bay.提供

マウスおよびヒト血清各10 μlからのEV単離例

マウスおよびヒト血清からのEV単離例
試料 総収量 濃度 純度
マウス
血清		 33.2μg 2.7×109
particles/ml		 1.7×107
particles/μg
ヒト血清 25.0μg 2.95×109
particles/ml		 4.7×107
particles/μg

他社SEC columnとの比較

ヒト血清20μlより本製品を用いて単離した各フラクションのEV収量と、ヒト血清100μlからA社SECカラムを用いて単離した各フラクションのEV収量を比較した。

フラクション番号 1 2 3 4 5
EV収量 SmartSEC Mini 128.0μg 40.8μg － － －
A社SECカラム 10.2μg 15.1μg 14.1μg 19.4μg 37.2μg

ヒト血清から単離したEVについてのMSによるタンパク質分析

本製品を用いてヒト血清20μlからEVを単離し、マススペクトログラフィー（MS）により約600種類のタンパク質を同定した。

ヒト血清から単離したEVのMS分析結果

同定したタンパク質の機能面での濃縮についてFunRichツールを使用して分析したところ、エクソソーム関連タンパク質が50％以上、血液微粒子関連タンパク質が30％未満、 また、リポタンパク質粒子関連タンパク質が10％未満であり、エクソソーム関連タンパク質が濃縮されていることがわかる（代表的なリストを以下に示した）。

  • Uniprot Accession No.：タンパク質名
  • P60709：Actin, cytoplasmic 1; Beta-actin
  • P02765：Alpha-2-HS-glycoprotein
  • P62805：Histone H4
  • P26927：Hepatocyte growth factor activator
  • B4DY90：Tubulin beta chain
  • P00338：L-lactate dehydrogenase A chain
  • P08183：ATP-dependent translocase
  • Uniprot Accession No.：タンパク質名
  • P80108：Phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D
  • P55058：Phospholipid transfer protein
  • P21926：CD9 antigen
  • P11597：Cholesteryl ester transfer protein
  • P07355：Annexin A2
  • P08238：Heat shock protein HSP 90-beta; HSP 90
  • P08962：CD63 antigen

SmartSEC Mini EV Isolation Systemの操作方法概略

ワークフロー

SmartSEC Mini EV Isolation Systemの操作方法概略

  1. 前洗浄したSmartSEC Mini columnに試料をロードし、室温で30分間インキュベートする。
  2. 500×gで30秒間遠心分離する。
  3. 溶出したEVを回収する。
  4. （オプション）回収率を最大にするには、カラムへのバッファーの追加・遠心・回収を最大2回行う。

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SmartSEC Single EV Isolation System（#SSEC200A-1）

血清、血漿、脳脊髄液（CSF）、および血リンパ（ジャンボアメフラシ）の試料からエクソソームなどのEV（Extracellular vesicles、細胞外小胞）をSEC（サイズ排除クロマトグラフィー）により単一カラムで単離するキットです。100～250μlの試料から約30分間で高品質のEVを単離できます。


SmartSEC Single EV Isolation Systemの使用例

ウエスタンブロッティングによるEVの収率の比較

ウエスタンブロッティングの分析結果から、SmartSEC SingleはA社SECカラムに比べて精製EVが高収率で得られた。

ウエスタンブロッティングによる比較例
試料 血清
EV単離方法 SmartSEC Single A社SECカラム
濃度 0.40μg/μl 0.06μg/μl
溶出液量 750μl 1,500μl
総回収量 300μg 90μg

fNTAによるEVの収率と粒径の比較

fNTAの分析結果から、SmartSEC SingleはA社SECカラムに比べて精製EVが高収率で得られた。

fNTAによる比較例
試料 血清
EV単離方法 SmartSEC Single A社SECカラム
濃度 9.3×1010 particles/ml 6.7×109 particles/ml
回収量 6.9×1010 particles 1.0×1010 particles
純度 23.3×1010 particles/mg 11.0×109 particles/mg

脳脊髄液（CSF）からのニューロンEVの単離

ExoCheck Neuro Arrayの結果より、SmartSEC Singleを用いることによりニューロンとエキソソームの両方のマーカーを含んだEVが得られたことがわかる。これは、SmartSEC Singleで単離されたEVがニューロン起源の小胞に富んでいることを示唆している。

脳脊髄液（CSF）からニューロンEVの単離
試料 CSF
EV単離方法 SmartSEC Single
濃度 0.08μg/ml
溶出液量 750μl
総回収量 60μg

血清および脳脊髄液（CSF）から単離したEVのサイズ

CSFから単離されたEVは、血清から単離されたEVに比べて粒径が小さくなる傾向があることがわかる。

血清および脳脊髄液（CSF）から単離したEVのサイズの比較
試料 CSF
EV単離方法 SmartSEC Single
濃度 9.3×1010 particles/ml
回収量 6.9×1010 particles
純度 23.3×1010 particles/mg

EVの透過型顕微鏡（TEM）解析

EVのTEM

SmartSECシングルを使用して血清から単離されたEVの透過型電子顕微鏡（TEM）像では、視認できるバックグラウンドの破片がほとんどない、典型的なEV形態（膜の二重層を備えた無傷の小胞）を有していた。

SmartSEC Single EV Isolation Systemの操作方法概略

SmartSEC Single columnに100～250μlの清澄化された血清または血漿とColumn buffer、または最大4 mlのその他の生体液を加え、直接洗浄済みカラムにロードし、インキュベートした後に、遠心してEVを溶出します。

操作法概略

  1. 洗浄済みのSmartSEC Single columnに試料をロードし、室温下で30分間インキュベートする。
  2. 500×gで1分間遠心分離する。
  3. フロースルーに単離されたEVが得られる。

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SmartSEC HT EV Isolation System（#SSEC096A-1）

血清または血漿からエクソソームなどのEV（Extracellular vesicles、細胞外小胞）をハイスループットで簡便、迅速に単離することができる96wellプレートベースのキットです。SEC（サイズ排除クロマトグラフィー）の長所をすべて有し、かつ超遠心分離や他社のSECカラムを用いた場合に比べて高純度のEVを高収率で単離することができます。

SmartSEC HT EV Isolation Systemの使用例

様々な方法で単離したEVのウエスタンブロッティングによる分析

500μlの血清（A）および血漿（B）から、本製品、超遠心分離および他社のSECカラムを用いてそれぞれEVを分画、単離し、それぞれの1回目の分画画分から1μgのタンパク質を取り、ウエスタンブロッティング解析を行った。本製品を用いて単離したEVは、超遠心分離および他社SECカラムを用いた場合に比べて夾雑のキャリーオーバー（持ち込み）タンパク質が少ないEVが高収率で回収されていることがわかる。

血清、血漿からのEVの収率と純度

試料量の違いによる溶出プロファイルの検討

EVの大部分は、最初の2つの画分に溶出する。SEC法では、一般に溶出プロファイルは添加した試料量と溶出液量により異なる。血漿250μlを添加した場合（A）、第2画分に最も多くのEVが溶出される。一方、血漿500μlを添加した場合（B）では、第1画分にEVが多く溶出される。したがって、本製品を初めてご使用される際には、まず第1画分と第2画分をそれぞれ別に分離して分析を行った上で、その結果に基づいて一方の画分のみを用いるか、2つの画分を一緒にして用いるかを選択することが望ましい。

画分解析
画分解析

EVの収率の比較

試料 試料量 EVの単離方法 EVの収率
（μg protein）		 EVの収率
（number of particles）
血清 250μl SmartSEC HT 239 1.48×1011
超遠心分離 4.34 0.08×1011
他社のSECカラム 101.6 0.44×1011
500μl SmartSEC HT 1,220 2.50×1011
超遠心分離 5.4 0.05×1011
他社のSECカラム 152.5 0.72×1011
血漿 250μl SmartSEC HT 159 2.62×1011
超遠心分離 3.77 0.014×1011
他社のSECカラム 76 0.80×1011
500μl SmartSEC HT 2,026 3.40×1011
超遠心分離 4.4 0.03×1011
他社のSECカラム 112 0.277×1011

プレートウェル間の一貫性の検証

500μlの血清（A）と血漿（B）を異なるウェルにロードし、EVを分離して、fNTAで分析した。血清と血漿の両方の試料において、EV粒子総数と粒子サイズ分布は、異なるウェル間においても高い再現性が確認できた。

プレートウェル間の一貫性の検証1
プレートウェル間の一貫性の検証2

SmartSEC HT EV Isolation Systemの操作方法概略

SmartSEC HTキットは、適切量のSmartSECレジンがあらかじめ充填された96ウェルフィルタープレート、SmartSEC isolation bufferおよびコレクションプレート2枚より構成されています。フィルタープレートの各ウェルには、250～500μlの血清または血漿を添加することができます。また、SmartSEC HT システムのすべてのステップは、手動操作および自動分注システムに適応します。

操作法概略

  1. 透明な血清または血漿をSmartSEC HT plateに添加し、室温下、30分間インキュベートする。
  2. 500×gで2分間遠心分離する（第1画分が得られる）。
  3. SmartSEC HT isolation bufferを各ウェルに添加し、500×gで2分間遠心分離する（第2画分が得られる）。

※ 各画分の詳細については、使用例をご覧下さい。

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SmartSEC Mini EV Isolation System

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様々な生体液試料から簡便にエクソソームなどのEV（Extracellular vesicles，細胞外小胞）を単一のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて単離するキット。Mini columnフォーマット。
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SmartSEC HT EV Isolation System(for Serum & Plasma), Trial Size, 8tests
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SmartSEC HT EV Isolation System(for Serum & Plasma), 96tests
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様々な生体液試料から簡便にエクソソームなどのEV（Extracellular vesicles，細胞外小胞）を単一のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて単離するキット。96 well plateフォーマット。
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メーカーインタビュー

System Biosciences 社は、エクソソーム研究のための革新的なツールと受託サービスを提供している米国のメーカーです。今回は、SBI社が提供する最新のエクソソーム回収キット、SmartSECシリーズについてお話を伺いました。
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System Biosciences社のスタッフたち

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（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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