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細胞膜を起点とした経路特異的なシグナル伝達の活性化に! タンパク質の細胞膜局在誘導試薬 SLIPT-PM

掲載日情報:2022/07/14 現在Webページ番号:70604

フナコシ /
フナコシ株式会社
[メーカー略称:FNA]

SLIPT法はタンパク質の細胞内局在を低分子化合物により制御する基盤技術で、SLIPT-PMはSLIPT法において細胞膜への局在移行を誘導する化合物です。
目的のシグナルタンパク質を専用タグiK6DHFRの融合タンパク質としてあらかじめ発現させた細胞にSLIPT-PMを添加することで、目的タンパク質を速やかに細胞膜に輸送することができます。細胞膜上で機能活性化を示すシグナルタンパク質であれば、リガンドによる上流レセプターの刺激を必要とすることなく、下流のシグナル経路を活性化することができ、狙ったシグナル経路に着目した各種解析を行うことができます。

本製品は名古屋工業大学の研究成果をもとにフナコシ(株)が製品化し、販売しています。
SLIPT-PMのアプリケーション例はこちらの記事をご覧下さい。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

SLIPT-PのM要約図

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従来のリガンドを用いたレセプター下流シグナルの活性化(左)とSLIPT-PMを用いた目的シグナルタンパク質特異的な膜輸送と活性化(右)のイメージ図

左ではレセプターの下流の複数のシグナルが同時に活性化されるのに対し、右ではレセプターシグナル不要で目的のシグナルタンパク質の下流のみを活性化できる。細胞膜上で活性化する機構を有するシグナルタンパク質であれば広く応用することができる。

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SLIPT法およびSLIPT-PMについて

SLIPT法とは

従来、シグナル伝達の解析はシグナル経路の最上流であるレセプターのリガンドによる活性化を起点とし、その応答を観察することが一般的でした。しかし、リガンドを用いてレセプターを活性化するとレセプターの下流の様々なシグナル経路が同時に活性化され、複数のシグナル経路の総和の応答が観察されます。個々のシグナル経路は相互にクロストークすることもあり、さらに解析を複雑化しています(左図)。この課題を解決するため様々な解析ツールの開発が進められていますが、特定のシグナル経路のみを活性化できるような汎用的技術は不十分でした。

SLIPT-PMについて

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SLIPT法(Self-localizing ligand-induced protein translocation)は、2013年に現・名古屋工業大学 築地真也 教授らにより開発された「化合物によりタンパク質の細胞内局在をコントロールする基盤技術」で、オルガネラ移行性の化合物を用いて狙ったタンパク質を特定のオルガネラに局在化させることに成功しています。SLIPT-PMは、SLIPT法に用いる化合物のうち細胞膜への局在誘導に特化した化合物で、任意の標的タンパク質をiK6DHFRと呼ばれるSLIPT-PM専用のタグタンパク質と繋いだ融合タンパク質(以下iK6DHFR融合タンパク質と略)として細胞に発現させることで、SLIPT-PM添加後数分単位の時間軸で細胞膜に移行させることができます。iK6DHFR融合タンパク質として発現させる標的タンパク質が、細胞膜上で活性化し下流シグナル因子を誘導できる性質を示すものであれば、iK6DHFR融合タンパク質の発現細胞にSLIPT-PMを添加することで、標的タンパク質よりも上流シグナルを必要とせず、下流シグナルの活性化を誘導することが可能です。
実際に、下記の代表的なシグナル経路についてレセプターの活性化を用いずに、中間因子から特異的に活性化することに成功しています(右図)。

  • cRaf-MEK-ERK経路
  • RasGEF-Ras-Raf-MEK-ERK経路
  • q-PLCβ-PIP2-IP3-Ca2+経路
  • s-adenylate cyclase-cAMP経路
  • PI3K-PIP3-Akt経路
  • RacGEF-Rac-actin経路
  • PKCσ-Raf-MEK-ERK経路

SLIPT-PMを使うには何が必要?

SLIPT法は3種類のコンポーネント、①オルガネラ局在を決める局在性リガンドと②リガンドに結合するタグタンパク質、および③局在解消剤から構成されます。①局在性リガンドで②タグタンパク質を局在移行させたのち、任意のタイミングで③局在解消剤を添加することで、タグタンパク質に融合した任意のタンパク質の局在を可逆的に制御することができます。
SLIPT-PM(本試薬)は細胞膜選択的な①局在性リガンドで、本試薬とは別途②タグタンパク質の発現用にiK6DHFR融合タンパク質発現ベクターをご準備いただく必要があります。iK6DHFR融合タンパク質発現ベクターはプラスミドバンクであるaddgeneより入手いただくことが可能です。詳しくは、後述のSLIPT-PM実験の始め方をご参照下さい。

SLIPT-PMを使うには何が必要?

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詳細な学術背景や原理などはSLIPT-PMユーザーガイドブックをご参照下さい。

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デモンストレーション

SLIPT-PMによるiK6DHFR融合EGFPの細胞膜局在化とFree-TMPによる膜局在の解消

使用したコンストラクト:EGFP-iK6DHFR (Addgene ID:172100)

  • SLIPT-PM濃度:10 μM(0 minで添加)
  • Free-TMP濃度:100 μM(30 minで添加)
  • 使用した細胞:HeLa
  • 反応培地:無血清DMEM培地

HeLa細胞でEGFP-iK6DHFRを発現させると主に細胞質に局在が観察されます。ここにSLIPT-PM(10 μM)を添加すると速やかに細胞膜に移行(t1/2~1.5 min)し、安定に繋留されます。少なくとも数時間単位で細胞膜上に維持されることが分かっています。SLIPT-PM添加後30分において、洗浄操作をせずにFree-TMPを添加することで、EGFP-iK6DHFRとSLIPT-PMの結合はFree-TMPに置き換わり、膜局在が解消される様子が観察されています。


SLIPT-PMによるiK6DHFR融合EGFPの細胞膜局在化とFree-TMPによる膜局在の解消

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SLIPT-PMによるiK6DHFR融合EGFPの細胞膜局在化とFree-TMPによる膜局在の解消

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アプリケーション例

下記のシグナル経路について、実験モデルと実績結果をご参照いただけます。

経路 活性化因子 下流因子 紹介ページ
Ras経路 Raf MEK-ERK こちらをクリック
Grb2/SOS1 Ras-Raf-MEK-ERK こちらをクリック
q経路 q PLCβ-PIP2-IP3 こちらをクリック
s経路 s Adenylate cyclase-cAMP こちらをクリック
RacGEF-Rac経路 RacGEF(Tiam1) Rac-actin こちらをクリック
PI3K-Akt経路 PI3K PIP3-Akt こちらをクリック

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SLIPT法およびSLIPT-PMの詳細

SLIPT法およびSLIPT-PMの学術背景や原理、実験構築の注意点などはSLIPT-PMユーザーガイドブックに詳述しております。ご購入を検討されている方は、下記よりダウンロードのうえご参照下さい。
SLIPT-PMユーザーガイドブックのダウンロードはこちら

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キット内容

  • SLIPT-PM(0.2 mg/vial)
  • SLIPT supplement (Free-TMP)(5 mg/vial)

局在解消剤として使用
注意iK6DHFR発現プラスミドは本製品に同梱されていません。 SLIPT-PM実験の始め方をご参照いただき、適切なiK6DHFR発現プラスミドを別途ご用意いただく必要があります。

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SLIPT-PM実験の始め方

SLIPT-PM (#FDV-0045)とは別にiK6DHFR発現プラスミドをご準備いただく必要があります。試薬SLIPT-PMのご購入だけではSLIPT法は実施できませんので、下記のフローをご購入前に必ずご参照下さい。


iK6DHFR発現プラスミドの選択方法・入手方法

マルチクローニングサイトを有するiK6DHFR発現プラスミド(EGFP融合タンパク質)およびポジティブコントロール用発現プラスミドはaddgeneで入手いただく、またはeDHFR (WT) をもとにご作製いただく必要があります。addgeneのプラスミド登録情報は下記をご参照下さい。
本ウェブ記事で紹介する各種アプリケーション実験に使用されている発現プラスミドもaddgeneから入手できます。eDHFR (WT) をもとにご自身で作製される場合は、参考文献3をご参照下さい。

用途 プラスミド名 addgene ID
任意のタンパク質XをiK6DHFRのC末端に入れたい
(EGFP-iK6DHFR-X)
pCMV-EGFP-eDHFR(69K6)-MCS 172100
任意のタンパク質XをiK6DHFRのN末端に入れたい
(X-iK6DHFR-EGFP)
pCMV-MCS-eDHFR(69K6)-EGFP 172101

iK6DHFR=eDHFR(69K6)


各種ポジティブコントロール用発現プラスミド

活性化する経路 本マニュアルにおけるコンストラクト名 addgeneプラスミド名 addgene ID
cRaf-MEK-ERK経路 EGFP-iK6DHFR-cRaf pPBpuro-EGFP-eDHFR(69K6)-cRaf 178849
cRaf-mNeonGreen(mNG)-iK6DHFR pPBpuro-cRaf-mNG-eDHFR(69K6) 172107
q経路 mNeonGreen(mNG)-iK6DHFR-Gαq pCAGGS-mNG-eDHFR(69K6)-G-alpha-q 172106
mNeonGreen(mNG)-iK6DHFR-Gαq (L254A) pCAGGS-mNG-eDHFR(69K6)-G-alpha-q(L254A) 178851
Gαs経路 miRFP670-iK6DHFR-Gαs pPBpuro-miRFP670-eDHFR(69K6)-G-alpha-s 172105
miRFP670-iK6DHFR pCSIIpuro-miRFP670-eDHFR(69K6) 178852
PI3K-Akt経路 mNeonGreen(mNG)-iK6DHFR-p85iSH2 pPBpuro-mNG-eDHFR(69K6)-p85iSH2 172103
mNeonGreen(mNG)-iK6DHFR pCSIIpuro-mNG-eDHFR(69K6) 178853
RacGEF-Rac経路 mNeonGreen(mNG)-iK6DHFR-Tiam1DH-PH pPBpuro-mNG-eDHFR(69K6)-Tiam1 172102
mNeonGreen(mNG)-iK6DHFR pCSIIpuro-mNG-eDHFR(69K6) 178853
Grb2/SOS1-Ras-Raf-MEK-ERK経路 Grb2mimic-iRFP713 pCAGGS-chGrb2/eDHFR(69K6)-iRFP713 178854
iK6DHFR-iRFP713 pCAGGS-eDHFR(69K6)-iRFP713 178855

各実験例は上記アプリケーション例をご参照下さい。

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使用文献

  1. Hino, N., et al., "A feedback loop between lamellipodial extension and HGF-ERK signaling specifies leader cells during collective cell migration.", Dev. Cell, 57(19), 2290~2304 (2022). [PMID:36174555]

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参考文献

  1. SLIPTの原著論文:
    Ishida, A.,et al., "Synthetic self-localizing ligands that control the spatial location of proteins in living cells.", J. Am. Chem. Soc., 135(34), 12684~12689 (2013). [PMID:23941503]
  2. SLIPT-PM (mDcTMP) の原著論文:
    Nakamura, A., et al., "Designer palmitoylation motif-based self-localizing ligand for sustained control of protein localization in living cells and Caenorhabditis elegans.", ACS Chem. Biol., 15(4), 837~843 (2020). [PMID:32182034]
  3. SLIPT-PM (mDcTMP)とiK6DHFRペアの原著論文:
    Suzuki, S., et al., "A chemogenetic platform for controlling plasma membrane signaling and synthetic signal oscillation.", Cell Chem. Biol., 29(9) (2022). [PMID:35835118]
  4. SLIPT-PMの日本語総説:
    築地真也、細胞内シグナル分子を特異的に活性化する新ツール"SLIPT"、『生体の科学』、74、595~601 (2023).
    [医書.jp URL:https://webview.isho.jp/journal/detail/abs/10.11477/mf.2425201798]

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[在庫・価格 :2024年05月25日 08時35分現在]

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SLIPT-PM
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説明文
※本製品には専用タグタンパク質の発現ベクターは含まれていません。別途用意が必要です。 「タンパク質の細胞内局在を低分子化合物により制御する基盤技術;SLIPT法」のうち細胞膜輸送に特化した化合物。目的のシグナルタンパク質を専用タグの融合タンパク質としてあらかじめ発現させた細胞にSLIPT-PMを添加することで,目的タンパク質を速やかに細胞膜に輸送することができる。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2023年8月合併号 p.41

製品記事 SLIPT-PMのアプリケーション例
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SLIPT-PM

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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