ヒドロキシプロリンおよびコラーゲン定量キット QuantiChrom Hydroxyproline Assay Kit

本アッセイでは、試料中のヒドロキシプロリンが酸化されてピロール環になります。この化合物は、キットに含まれるDye reagentと反応してピンク色に発色します。560 nmにおける吸光度は、試料中のヒドロキシプロリン濃度に比例します。また、ヒドロキシプロリンは、ほぼコラーゲンにのみ見られるため、ヒドロキシプロリン含有量は、コラーゲン含有量としても代用できます。

本製品は遊離のヒドロキシプロリンを測定するため、コラーゲン含有試料は測定前に加水分解を行う必要があります。試料を加水分解するには、試料50μlを入れたエッペンドルフチューブに、まず10N NaOHを50μl加え、その後チューブを100℃で1時間加熱します（固形試料の場合には、より長い時間の加熱が必要な場合があります）。チューブを冷却後、10N HClを50μl加えて中和します。次に、試料と同量の脱イオン水150μlを加え希釈し、2分間遠心分離して残留物を沈殿させ、可溶分全量を回収します。

50μg/mlのヒドロキシプロリンは、5 mg/dl、または50 ppmに相当します。ヒドロキシプロリンはコラーゲン中に重量比で平均13％含まれています。1μg/mlのヒドロキシプロリンは、7.69μg/mlのコラーゲン（1/0.13量）に相当します。

Bovine Skin Collagen Solution（Sigma-Aldrich、#C4243-20 ml）を上記の操作方法にしたがって消化し、コラーゲン含量を3.3±0.2 mg/mlと決定した。

※ キットには、透明平底96 wellマイクロプレートは含まれていません。別途ご用意下さい。比色法による測定にはマイクロプレートリーダーが必要です。

Q-1. 固体のコラーゲン試料（軟骨、腱など）を加水分解する方法を教えて下さい。

A-1. 水がすべて除去されるまで、乾燥オーブンで試料を乾燥させます（湿重量を測定できますが、乾式の方が正確です）。エッペンドルフチューブに加水分解する試料 150 mg当たり6N NaOH 50μlを加えます。ヒートブロックで100℃で1～2時間加熱します。チューブを冷却後、 等量の10N HClを加えて中和します。加えたNaOHとHClの量と等量の脱イオン水を加えます。（加水分解手順は操作方法概略をご参照下さい）。

Q-2. Hydroxyproline standardを加水分解する必要がありますか？

A-2. Hydroxyproline standardとブランクは、加水分解を受けるかどうかに関係なく非常に類似していることが分かっています。したがって、本製品では、Hydroxyproline standardの加水分解処理は不要です。

Q-3. 別の温度で最後のインキュベーションを行うことができますか？

A-3. インキュベーションは45℃で50分間に設定できます。プロトコルでは、37℃を使用するようにしています。これは、プレートリーダーまたは組織培養用のインキュベーターで行えるようにするためです。一部のプレートリーダーは45℃に加熱できない場合があります。

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