生細胞で使用可能な不可逆的GST阻害物質 CNBSF（Irreversible GST Inhibitor）

CNBSFは化学的反応性が高く、DMEMなどの基礎培地中で培地成分との副反応生成物が認められます（DMEM中37℃条件下10分間で60%、30分間で約95%分解）。そのため、生細胞実験においてはHBSなどの無機塩類をベースとしたバッファーの使用を推奨しています。CNBSFはDMSOストック溶液として安定的に保管できますが、ワーキング溶液は添加直前に調製し、直ちに使用して下さい。HBS中であっても徐々にsulfonyl fluoride基の加水分解が認められ（HBS中37℃条件下30分で約50%、60分で約70%の加水分解）、薬効の低下につながります。培地中で使用する場合は、使用濃度を高めに設定（eg. 100 μM～1 mM）し、実験に合わせた条件の最適化をご検討下さい。

アッセイバッファー（50 mM sodium phosphate (pH 7.4), 150 mM NaCl）にGSH 10 μM、およびヒトまたはマウスの組換細胞質型GSTメンバーを添加した。事前にCNBSF 100 μMを30分間処理し、次にGST活性測定プローブ☞ CellFluor™ GST（終濃度5 μM）を添加し、その30分後に蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。各GST酵素におけるCNBSF非存在下の☞ CellFluor™ GST由来の蛍光強度を100%としてCNBSFの効果を相対的な蛍光強度により定量した。

細胞質型のいずれのGSTに対してもCNBSFは強い阻害活性を示した。

アッセイバッファー（PBS）にヒト組換GSTM1、GSTA1、GSH 100 μM, またはCNBSF 100 μMを添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベートした試料を2分割し、片方（Dialysis(+)）は微量透析キットによりPBSで30分間透析後、透析有無での液量を補正した。それぞれさらにGSH 100 μM、☞ CellFluor™ GST 1 μMを加えて30分間インキュベートし、蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。

GSTM1、GSTA1ともにCNBSFの添加後に透析を行っても活性の回復は見られらなかった。

CHO細胞を1×10⁴ cells/wellで96 wellプレートに播種し、10%FBS含有DMEM培地で20時間培養した。培地をHBSに置換し、100 μM CNBSFを3種類のプロトコールで処理した後に、2 μM ☞ CellFluor™ GSTを添加して1時間反応させ蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。

いずれのプロトコールにおいても蛍光強度の減衰が維持されたことから、CNBSFは生細胞内で不可逆的にGSTを阻害していることがわかる。

786-OおよびCHO細胞を1×10⁴ cells/wellで96 wellプレートに播種し、10%FBS含有DMEM培地で20時間培養した。培地をHBSに置換し、1～1,000 μM CNBSFを1時間処理した後に、それぞれに2 μM ☞ CellFluor™ GSTを添加して1時間反応し、蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。

いずれの細胞株においても4～5 μM程度のIC₅₀値を示した。

786-OおよびCHO細胞を1×10⁴ cells/wellで96 wellプレートに播種し、10%FBS含有DMEM培地で20時間培養後、培地をHBSに置換し、20 μM CNBSFまたは20 μMエタクリン酸（EA、Ethacrynic acid）存在下で1時間培養した。次に☞ CellFluor™ GST (終濃度2 μM）を添加し、1時間反応させた後に蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。

いずれの細胞においても20 μM濃度においてはエタクリン酸に比べてCNBSFの方が高いGST阻害活性を示した。

786-OおよびNeuro2a細胞を1×10⁴ cells/wellで96 wellプレートに播種し、10%FBS含有DMEM培地で20時間培養後、培地をフェノールレッド不含・FBS不含DMEM培地（以下DMEM（−）と略）に置換した。CNBSFを処理する際は、100 μM CNBSFを含むHBSに置換し、20分間培養後、再度DMEM（−）に戻して0、1、2、4、6時間培養（Lag-time）した。その後一斉に☞ CellFluor™ GST（2 μM）を含むDMEM（−）に置換し、1時間培養した後に蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/ Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。

786-Oは少なくとも6時間までGSTの抑制効果が持続することが確認された一方で、Neuro2a細胞では経時的なGST活性の回復傾向が観察され、CNBSF処理後においても迅速なGST発現量の上昇が示唆された。

CHO細胞を1×10⁴ cells/wellで96 wellプレートに播種し、10%FBS含有DMEM培地で20時間培養後、100 μM CNBSFを含むHBSに置換し1時間前処理した。次に細胞をCNBSF不含のHBSで洗浄し、HBS中でH₂O₂（0.1 mMまたは0.5 mM）、一酸化窒素（NO）ドナー（SNAP; 0.1 mM）、またはラジカル開始剤（APS; 1 mM）を添加して20分間処理、またはCu²⁺（CuSO₄; 1 mM）を添加し5分間処理した。それぞれの細胞を再びCNBSF不含のHBSで洗浄し、脂質過酸化反応の後期生成物であるアクロレインの検出試薬☞ AcroleinRED（2 μM）またはネガティブコントロールとしてTAMRA（2 μM）を含むHBSを添加し、30分間反応した。細胞をHBSで3回洗浄し未反応の☞ AcroleinREDまたはTAMRAを除去した後、蛍光プレートリーダー（Ex 540±5 nm/ Em 580±10 nm）で蛍光強度を測定した。

各薬剤処理のみでもCHO細胞におけるアクロレイン量の増加が観察されたが、CNBSFでGST活性をあらかじめ抑制することでより顕著なアクロレイン産生量の増加が観察された。