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生細胞で使用可能な不可逆的GST阻害物質 CNBSF <Irreversible GST Inhibitor>

掲載日情報:2019/03/26 現在Webページ番号:68116

フナコシ /
フナコシ株式会社

CNBSF(2-Chloro-5-NitrobenzenSulfonyl Fluoride)はGlutathione S-transferase(GST)に対する不可逆的な阻害物質です。既知のGST阻害物質として汎用されるEthacrynic Acidと比べ,高い阻害活性を示します。また,不可逆的なため長期的なGSTの不活性化が可能です。
本製品は名古屋大学 理学研究科 阿部洋教授の研究成果を元に製品化されました。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


細胞画像

HeLa細胞にCNBSFを添加して細胞内のGSTを不可逆的に阻害後,残存GST活性を生細胞で使用できるGST活性測定プローブDNs-Rh(#FDV-0030)を用いて観察した。CNBSF添加により細胞内GSTの酵素活性が著しく抑制されていた。


GSTと阻害物質の意義

MEMO

GSTと阻害物質の意義

Gluthathione S-Transferase(GST)ファミリーはバクテリアから動物,植物と幅広く保存されている酵素ファミリーで,細胞内で疎水的な異物化合物(xenobiotics)をgluthathione(GSH)に付与し,GSH抱合体(GSH-conjugate)に変換する活性を有します。GSH抱合体は,MRP(multidrug resistance-associated protein)トランスポーターにより積極的に細胞外に排出され,異物が除去される機構が存在します。そのため,GSTは細胞毒となりうる異物化合物の排出に関わる解毒因子として機能しています。
一方,多くの抗がん剤等の医薬品もGSTによりGSH抱合体に変換され細胞外に排出されてしまうため,GSTは薬剤耐性因子として薬効を弱める負の効果も示します。特にがんの悪性化に伴い特定のGSTアイソフォーム(GSTP1)の発現量が亢進することが知られ,がん細胞は薬剤耐性を強く獲得すると考えられています。
GST活性を抑制することで抗がん剤の細胞内滞留性を向上することが期待されておりますが,現在までにGSTの阻害物質は十分とはいえない状況でした。従来のGSTの阻害物質は,GSHと競合することで阻害する競合性阻害物質が主に用いられてきました。しかし,これらの競合性阻害物質はin vitroでは優れた阻害活性を示しても,細胞内のGSH濃度は数mMオーダーと非常に高濃度であることから,細胞内では競合が起こりにくく十分な阻害効果が得られないという問題がありました。


耐性模式図

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新規GST阻害戦略 BSF阻害物質

MEMO

新規GST阻害戦略 BSF阻害物質

名古屋大学 阿部洋教授らは,benzensulfonyl fluoride(BSF)基を用いた新たなGST阻害戦略として「細胞内で不可逆的な阻害物質を作り出す」ことに取り組み,生細胞で優れた阻害活性を示すCNBSFの開発に成功しました1)。CNBSFは細胞膜透過性を示し,細胞内に取り込まれた後にGSTの異物認識部位であるH-siteに結合します。GSHはGSTのG-siteに結合し,GSTのタンパク質内部でCNBSFはGSHに付加されGSH抱合体(GS-5NBSF)に変換されますが,GS-5NBSFは直ちにGSTのTyr108(GSTP1-1の場合)と不可逆的に反応します。この反応によりGS-BSFはGSTから解離できずH-site,G-siteともに塞がれた状態になるため,GSTは不活性となります。従来の競合型阻害物質と比べ,不可逆的にGSTを不活性化するため,長期的な阻害が可能です。


BSF阻害模式図

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原理詳細

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特長

  • 膜透過性を有し,生細胞に使用可能です。
  • 細胞内でGSTによりGSHに付加されることで,GST阻害物質として機能します。
  • 不可逆的な阻害物質で,長期的な阻害が可能です。また,従来の可逆的な化合物とは異なり,洗浄操作後も阻害が維持されます。
  • GST阻害物質として知られるethacrynic acid(EA)に比べ,生細胞実験で高い阻害活性を示します。
  • 広範なGSTファミリーに反応すると考えられています。
  • 質量分析により内在性のGST(GSTP1-1)に共有結合することを確認しています。

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原著論文

  1. Shishido, Y., et al., ChemBioChem,20(7),900~905(2019)
    "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."

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使用例

不可逆的なGST阻害活性

GSTP1-1組換え体を用いて,in vitroにおける阻害活性を評価した。0.1 mMの阻害物質存在下でGSTP1-1を37℃で2時間反応させ,限外ろ過による洗浄作業の有無の後,1μM のGST活性測定プローブDNs-Rh(#FDV-0030)によりGSTの活性を評価した。ethacrynic acid(EA)は洗浄後にGST活性が回復していることから可逆的な阻害物質であることが分かるが,CNBSFは洗浄後も阻害活性が維持されていることから不可逆的にGSTを阻害していることが分かる。

不可逆性

生細胞におけるGSTの阻害活性

NCI-H522細胞をトリプシンで剥離し,浮遊させた状態で,1 mMの阻害物質を添加し,37℃で15分間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄した後,2.5μMのDNs-Rh(#FDV-0030)を添加し,37℃で1時間反応させた。その後細胞を再度PBSで洗浄し未反応の試薬を取り除いた後,フローサイトメーター(Ex 490 / Em 520 nm)で定量した。 CNBSFを添加した細胞では,GST活性がほぼ完全に消失しており,その効果はEAよりも高いことが分かった。

生細胞測定

質量分析によるGS-5NBSF結合部位の同定

化学合成したGS-5NBSFを精製GSTP1-1と反応させ不可逆的な付加体を調製した。トリプシン処理後,ペプチド断片のMS/MS解析で結合部位の同定を行った。Tyr108にGS-5NBSFが結合していることが分かった。

MS解析

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価格

[在庫・価格 :2019年08月24日 00時14分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
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CNBSF <Irreversible GST Inhibitor>
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説明文
Glutathione S-transferase(GST)に対する不可逆的な阻害物質。既知のGST阻害物質として汎用されるethacrynic acidと比べ,高い阻害活性を示し,不可逆的なため,長期的なGSTの不活性化が可能。
CAS No:3829-23-0
別名:2-chloro-5-nitrobenzensulfonyl fluoride
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ

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[在庫・価格 :2019年08月24日 00時14分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。

CNBSF <Irreversible GST Inhibitor>

文献数:0

  • 商品コード:FDV-0031
  • メーカー:FNA
  • 包装:10mg
  • 価格:¥30,000
  • 在庫:3個以上
  • 納期:-
  • 法規制等:

説明文 Glutathione S-transferase(GST)に対する不可逆的な阻害物質。既知のGST阻害物質として汎用されるethacrynic acidと比べ,高い阻害活性を示し,不可逆的なため,長期的なGSTの不活性化が可能。
CAS No:3829-23-0
別名:2-chloro-5-nitrobenzensulfonyl fluoride
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ

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