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生細胞ハイスループットスクリーニングに最適なGST活性測定試薬 CellFluor® GST

掲載日情報：2023/07/20 現在Webページ番号：68115

フナコシ /
フナコシ株式会社
[メーカー略称：FNA]

生細胞に適用できるGlutathione S-transferase（GST）の酵素活性応答性蛍光プローブです。細胞内に迅速に取り込まれ、細胞内GSTにより緑色蛍光を発するため、生細胞レベルでのGST活性の評価に有用です。測定前の洗浄も不要で、培地に試薬を添加するだけのプロトコルのため、蛍光プレートリーダーを用いたハイスループットスクリーニングを簡便に構築することができます。細胞・組織ライセートなどのin vitroアッセイにも使用でき、さらに従来試薬に比べて検出感度が高いという利点もあります。
※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


製品名変更のお知らせ

本製品は、以下のとおり製品名を変更いたしました。
※ なお、製品仕様、商品コード、価格、容量に変更はございません。

  • 旧品名：DNs-Rh
  • 新品名：CellFluor® GST

CellFluor<sup>®</sup>GST概要図

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CellFluor® GST概要図

CellFluor® GSTは、Rhodamine110にGST応答性保護基を導入した無蛍光性化合物で、優れた細胞透過性を有する。また、細胞内において各種GSTによって保護基が除去されることによりRhodamine110の緑色蛍光を生じる。蛍光プレートリーダーや蛍光顕微鏡観察により緑色蛍光強度を測定することで、生細胞レベルでのGST活性を評価することができる。

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GSTとその活性測定手法について

GSTについて

Glutathione S-Transferase（GST）ファミリーは、バクテリアから動物、植物まで幅広く保存されている酵素ファミリーで、第Ⅱ相薬物代謝酵素の1つです。第Ⅰ相薬物代謝酵素シトクロムP450により細胞内で産生された求電子代謝物や、細胞外から取り込まれた異物化合物（xenobiotics）をグルタチオン（Glutathione; GSH）に付与し、グルタチオン抱合体（GS抱合体、GS-conjugate）に変換する活性を有しています。グルタチオン抱合体は、多剤耐性関連タンパク質（Multidrug resistance-associated proteins；MRP）トランスポーター群により積極的に細胞外に排出され、毒性を軽減させる機構が存在します。そのため、GSTは細胞毒となりうる代謝物質や異物化合物の排出にかかわる解毒因子として機能すると考えられています。細胞内の主たる抗酸化因子として、酸化ストレスや脂質過酸化反応の抑制にも寄与すると考えられています。

一方、多くの抗がん物質などの医薬品はGSTの基質となりうることから、GSTによりグルタチオン抱合体に変換されて細胞外に排出されるケースが報告されています。また、GSTは薬効を低下させる薬剤耐性効果も示します。特に、がんの悪性化にともない特定のGSTアイソフォーム（GSTP1）の発現量が亢進することが知られ、それによりがん細胞は薬剤耐性を獲得すると考えられています。


細胞内でのGSTの作用機構

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細胞内でのGSTの作用機構


GSTの活性測定における問題点とCellFluor® GSTについて

このように、GSTは第Ⅱ相薬物代謝酵素として抗酸化因子、異物代謝・解毒作用因子、薬剤耐性因子と多機能を有することから、生細胞におけるGST活性の測定技術が求められています。しかし、従来のGST活性の測定は、細胞ライセートを用いたin vitroアッセイによる方法に限られていました。CellFluor® GSTは、細胞膜透過性を有する低分子化合物であり、GSTの活性により緑色蛍光を生じるGST活性応答性プローブです。in vitroアッセイのみならず生細胞アッセイで使用できることから、蛍光プレートリーダー、蛍光イメージング、フローサイトメトリーなど各種細胞ベース蛍光アッセイ（Cell-based fluorescent assay）に適用でき、生細胞でのGST活性の定量比較や刺激依存的なGST活性のモニタリングが可能です。また、蛍光プレートリーダーを用いることで、生細胞ベースでハイスループットなGST阻害物質探索にも有用です。


GST活性測定用プローブの比較

商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

プローブ名 CellFluor® GST
（本製品）		 CDNB
（従来法）
商品コード FDV-0030 －
測定方法 緑色蛍光 UV
測定波長 励起 496 nm／蛍光 520 nm ～340 nm
測定対象 広範なGSTファミリー
実験系 in vitro
（ライセートや精製酵素など）		 可 可
生細胞 蛍光プレートリーダー 可 不可
イメージング 可 不可
フローサイトメトリー 可 不可
測定感度 高い
（蛍光のため）		 低い
（UV吸収のため）
ハイスループット性・簡便性 高い
（生細胞のまま観察可能で、洗浄操作も不要）		 低い
（ライセート調製が必要）
他の因子との同時測定 可
（青色蛍光や赤色蛍光を併用可能）		 困難

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原理

CellFluor® GSTは、幅広いGSTの基質である2,4-dinitrobenezensulfonamide（DNB）を緑色蛍光色素Rhodamine 110に2つ付加した化合物で、通常は消光状態になっています（量子収率 0.0007）。GSTによりDNB基が外れてグルタチオン抱合体に変換されると、Rhodamine110（量子収率 0.647）が放出され、緑色蛍光（励起極大波長 496 nm／蛍光極大波長 520 nm）を発します。

CellFluor® GST（原著論文名 bis-DNs-RhまたはDNs-Rh）は、当初チオール基（-SH）を検出する試薬として開発されましたが、その後の解析によりGST活性の検出試薬として有効であることが分かりました。チオール基に対する応答性に比べGSTに対する応答性が著しく高いことから、CellFluo® GSTは生細胞用のGST活性測定プローブとして利用できます。細胞質型GST（GSTA、GSTM、GSTP、GSTO、GSTT、GSTZ）、およびミクロソーム型GST（MGST）に応答することが確認されています。

※ 注：各種チオール含有化合物に対しても弱いながら反応性を示します。アッセイバッファー中のチオール含有化合物（GSH、DTTなど）の濃度や反応時間には注意が必要です。


CellFluor<sup>®</sup>GSTの原理

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CellFluor® GSTの原理

生細胞アッセイ系においては、細胞内GSTの酵素活性により産生されたRhodamine 110はミトコンドリアを中心に細胞内に拡散しますが、細胞内滞留性は高くなく徐々に培地中に放出されます。そのため、蛍光プレートリーダーを用いる測定においては、CellFluor® GST添加後の培地交換を行わずにそのまま蛍光強度を測定することを推奨します。一方で、各種蛍光顕微鏡観察の場合では、培地中に放出されたRhodamine 110が観察時のバックグラウンドになる可能性もあり、洗浄後に速やかに観察することを推奨します。

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特長

  • GST活性によってRhodamine 110が放出され緑色蛍光を発します（Ex 496 nm/Em 520 nm）。
  • 生細胞アッセイ（蛍光プレートリーダー、蛍光イメージング、フローサイトメトリー）、およびin vitroアッセイ（精製酵素、細胞／組織ライセートなど）にも使用できます。
  • in vitroアッセイでは、従来のCDNBアッセイに比べて高い検出感度を示します。
  • 生細胞アッセイでは、細胞膜透過性により培地に添加するだけで使用できます。また、GSTの応答前後において高いSN比（量子収率比～900倍）を示すため、洗浄操作を必要とせずに測定できます。
  • さまざまなGSTファミリーに対し反応性を示します。

実績のあるGSTサブファミリー

  • GSTα（GSTA1、GSTA2、GSTA3、GSTA4） 
  • GSTμ（GSTM1、GSTM2）
  • GSTπ（GSTP1）
  • GSTω（GSTO1）
  • GSTθ（GSTT1）
  • GSTζ（GSTZ1）
  • MGST（MGST1）

※ 組換え体GSTO1およびGSTT1の精製タンパク質を用いた解析では、他の細胞質型GST（GSTA1、GSTM1、GSTP1、GSTZ1）に比べて活性が弱いことが認められています。


スペクトルデータ

Rhodamine 110の吸収スペクトル
CellFluor<sup>®</sup> GSTのGST応答性蛍光スペクトル

Rhodamine 110の吸収スペクトル

CellFluor® GSTのGST応答性蛍光スペクトル

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  • 左：吸収極大：495 nm
  • 右：アッセイバッファー（50 mM sodium phosphate（pH 7.4）, 150 mM NaCl）を使用し、励起光470 nmにおけるCellFluor® GST（1 μM）の蛍光スペクトルを測定した。CellFluor® GST単体および10 μM GSH存在下では蛍光は観察されなかったが、ヒト組換え体GSTM1（0.5 μg/ml）添加時において520 nm付近に極大を持つ蛍光が観察された。また、GSTM1、GSHおよびGST阻害物質☞ CNBSF（100 μM）で前処理した場合では、この蛍光が著しく抑制されることが観察された。

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使用例

組換え体GSTタンパク質を用いたin vitroアッセイ

組換え体GSTタンパク質を用いたin vitroアッセイ

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アッセイバッファー（50 mM sodium phosphate （pH 7.4), 150 mM NaCl）にCellFluor® GST 5 μM, GSH 10 μMを添加し、ヒト組換え体GSTM1（0.2 μg/ml）の存在下、非存在下で、分光蛍光光度計により蛍光強度（Ex 470±5 nm/Em 525±10 nm）を経時的に30分間測定した。GSTM1非添加条件下では、ほとんど蛍光強度の増加が認められなかった。一方で、GSTM1の添加により蛍光強度が顕著に上昇し、また添加から30分後まで直線的なシグナルの増加が観察された。


※ 細胞質型GSTサブメンバーGSTA1、GSTP1、GSTO1、GSTT1、GSTZ1についても、精製組換え体タンパク質を用いた場合と同様の実験結果が確認されています。GSTO1、GSTT1は、精製組換え体タンパク質の解析においては応答性が弱いことが認められています。
※ CellFluor® GSTは、チオール含有化合物に対しても弱い反応性を示します（☞ 原理参照）。in vitroアッセイ系におけるGSTの活性化にはGSHの添加が必要ですが、GSHの添加量に応じてバックグラウンドを生じるため、適切なネガティブコントロールを設定し、反応時間を検討することを推奨します。

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GST含有試料の濃度依存的蛍光応答性の評価

GST含有試料の濃度依存的蛍光応答性の評価

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アッセイバッファー（50 mM sodium phosphate （pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40、100 μM GSH）にマウス肝臓ライセートを総タンパク質終濃度10～10,000 ng/mlになるように添加した。次にCellFluor® GST（終濃度 1 μM）を加えて室温で30分間インキュベートした後、蛍光プレートリーダーで蛍光強度（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）を測定した。測定結果から肝臓ライセートのタンパク質濃度依存的なCellFluor® GSTの蛍光応答が確認でき（R2=0.9993）、本試料における検出限界は100 ng/ml（肝臓ライセート中の総タンパク質濃度換算）程度と決定した。

※ 同じ試料を用いて従来のCDNBアッセイ（GSH 1 mM, CDNB 1 mM）を行ったところ、検出限界は1,000 ng/ml程度であった。

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生細胞実験系における細胞数依存的な蛍光応答性の評価

生細胞実験系における細胞数依存的な蛍光応答性の評価

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CHO細胞を、2×104 cells/wellから2倍希釈系列にて96 wellプレートに播種（100 μl/well）した。4時間後にフェノールレッド・FBS不含DMEM培地で培養し接着を確認後、CellFluor® GST（2 μM）を添加し、3時間後まで1時間おきに蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。測定結果から反応時間依存的な蛍光強度の増加が確認でき、また播種時の細胞密度0.06 × 104 cells/wellまでに、各時間とも高い線形性が確認できた。

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蛍光プレートリーダーによる4種類の細胞株の生細胞GST活性の相対的評価

蛍光プレートリーダーによる4種類の細胞株の生細胞GST活性の相対的評価

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4種類の細胞株（チャイニーズハムスター卵巣がん細胞株 CHO、ヒト腎臓がん細胞株786-O、マウス神経芽腫細胞株 Neuro2a、ヒト胎児腎細胞 HEK293）を1×104 cells/wellで96 wellプレートに播種した。10% FBS含有DMEM培地で20時間培養後、培地を無血清・フェノールレッド不含のDMEM培地に交換した。次にCellFluor® GSTを終濃度2 μMになるように添加し1時間反応させ、その後培地交換はせずにそのまま蛍光プレートリーダー（透過型測定、Ex 475±5 nm/Em 525 nm±10 nm）で各ウェルの蛍光強度を測定した。評価した4種類の細胞株ではCHO細胞が最も高い蛍光値を示した。

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蛍光プレートリーダーによる生細胞GST活性の薬剤応答性評価

蛍光プレートリーダーによる生細胞GST活性の薬剤応答性評価

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786-O、Neuro2aおよびCHO細胞を1×104 cells/wellで96 wellプレートに播種し、10%FBS含有DMEM培地で4時間培養した。その後FBS不含のDMEM培地に置換し、Retinoic acid（5 μM）またはTunicamycin（1 μg/ml）存在下で20時間培養した。ここで、GST阻害物質である☞ CNBSFのみは100 μM HBS条件下で1時間培養した。次に培地をHBSに置換し、CellFluor® GST（2 μM）を添加して1時間培養後、蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。いずれの細胞においても☞ CNBSF添加によりGST活性が著しく抑制された。また、Retinoic acidではGST活性の増加、TunicamycinではGST活性の低下が観察された。

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蛍光顕微鏡による生細胞イメージング

蛍光顕微鏡による生細胞イメージング

3種類の細胞株（CHO、786-O、Neuro2a）をガラスボトムディッシュに播種し、10% FBS含有DMEM培地で20時間培養した。その後、無血清・フェノールレッド不含のDMEM培地に交換し、CellFluor® GSTを終濃度 30 μMになるように添加し、10分間反応させた。培地を交換し、直ちに落射型蛍光顕微鏡（Ex 435～475 nm/Em 530～543 nm）で観察した。いずれも細胞内から緑色蛍光シグナルが観察された。一方、事前にGST阻害物質である☞ CNBSFを処理（100 μM、30分）した場合では、細胞内蛍光が顕著に減弱していることが分かる。

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組織ライセートを用いたin vitroアッセイ

組織ライセートを用いたin vitroアッセイ

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マウス由来の4つの組織（肝臓、脳、脾臓、腎臓）を細かく切断後、可溶化バッファー（50 mM sodium phosphate（pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40）に懸濁した。遠心上清の可溶化画分の総タンパク質濃度をBCA法で定量し、各組織ともタンパク質濃度を1 mg/mlに調整した。アッセイバッファー（50 mM sodium phosphate（pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40、100 μM GSH）に各組織ライセートを総タンパク質の終濃度 0.1 mg/mlになるように添加し、最後にCellFluor® GST（終濃度1 μM）を添加した。室温で30分間反応後、蛍光プレートリーダー（Ex 475±5 nm/Em 525±10 nm）で蛍光強度を測定した。また、CellFluor® GSTの添加前にGST阻害物質である☞ CNBSF（終濃度 100 μM）を処理した試料も用意した。検証した4つの組織試料では、肝臓試料で顕著に強いGST活性が観察された。また、いずれの組織試料においても☞ CNBSFによりGST活性が阻害されることが確認できた。

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参考文献

  1. Shibata, A., et al., "Rhodamine-based fluorogenic probe for imaging biological thiol.", Bioorg. Med. Chem. Lett., 18(7), 2246～2249(2008). [PMID:18358719]
  2. Alander, J., et al., "Characterization of a new fluorogenic substrate for microsomal glutathione transferase 1.", Anal. Biochem., 390(1), 52～56(2009). [PMID:19348782]
  3. Zhang, J., et al., "Synthesis and characterization of a series of highly fluorogenic substrates for glutathione transferases, a general stategy.", J. Am. Chem. Soc., 133(35), 14109～14119(2011). [PMID:21786801]
  4. Shishido, Y., et al., "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in Human Cells.", ChemBioChem., 20(7), 900～905(2019）. [PMID:30548113]

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CellFluor GST <Cell-based GST Activity Assay Reagent>
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説明文
Glutathione S-transferase（GST）の酵素活性を生細胞で観察することができる蛍光プローブ。GST活性に応じて緑色の蛍光が発生するため，細胞内GSTの活性評価に有用。広範なGSTサブファミリーに交差するため，総GST活性を可視化できる。
法規制等
保存条件 -20℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2024年12月1日号 p.20
ニュース2022年11月15日号 p.20
ニュース2022年3月1日号 p.10

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CellFluor GST <Cell-based GST Activity Assay Reagent>

文献数： 0

説明文 Glutathione S-transferase（GST）の酵素活性を生細胞で観察することができる蛍光プローブ。GST活性に応じて緑色の蛍光が発生するため，細胞内GSTの活性評価に有用。広範なGSTサブファミリーに交差するため，総GST活性を可視化できる。
法規制等
保存条件 -20℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2024年12月1日号 p.20
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お問い合わせ先

（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。

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