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生細胞で使用できるGSTの活性測定プローブ DNs-Rh <Cell-based GST Activity Assay Reagent>

掲載日情報:2019/03/26 現在Webページ番号:68115

フナコシ /
フナコシ株式会社

DNs-RhはGlutathione S-transferase(GST)の酵素活性を生細胞で観察することができる蛍光プローブです。GST活性に応じて緑色の蛍光が発生するため,細胞内GSTの活性評価に有用です。広範なGSTサブファミリーに交差するため,総GST活性を可視化できます。
本製品は名古屋大学大学院 理学研究科 阿部洋教授の研究成果を元に製品化されました。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


細胞画像

DNs-Rhは細胞膜透過性を有し,細胞内でGSTの酵素活性により緑色蛍光色素に変換されます。顕微鏡やフローサイトメトリーによる蛍光量の定量でGST活性を相対定量可能です。


GSTとその活性測定手法について

MEMO

GSTとその活性測定手法について

Gluthathione S-Transferase(GST)ファミリーはバクテリアから動物,植物と幅広く保存されている酵素ファミリーで,細胞内で疎水的な異物化合物(xenobiotics)をgluthathione(GSH)に付与し,GSH抱合体(GSH-conjugate)に変換する活性を有します。GSH抱合体は,MRP(multidrug resistance-associated protein)トランスポーターにより積極的に細胞外に排出され,異物が除去される機構が存在します。そのため,GSTは細胞毒となりうる異物化合物の排出に関わる解毒因子として機能しています。
一方,多くの抗がん剤等の医薬品もGSTによりGSH抱合体に変換され細胞外に排出されてしまうため,GSTは薬剤耐性因子として薬効を弱める負の効果も示します。特にがんの悪性化に伴い特定のGSTアイソフォーム(GSTP1)の発現量が亢進することが知られ,がん細胞は薬剤耐性を強く獲得すると考えられています。
このようにGSTは異物代謝・解毒作用因子,薬剤耐性因子として機能することから,細胞内のGST活性を測定する技術が求められていますが,従来の方法ではin vitroにおける活性測定に限定されており,生細胞で活性を観察できる手法は,ほとんどありませんでした。
名古屋大学 阿部洋教授らにより開発されたDNs-Rhは細胞膜透過性の化合物で,GSTの酵素活性に応じて緑色蛍光を生じるGST活性応答性プローブです。生細胞で使用できることから,各種細胞のGST活性の定量化や刺激依存的なGST活性のモニタリングに加え,従来難しかった細胞ベースでの阻害物質探索などさまざまなアプリケーションに応用可能です。


耐性模式図

GST活性測定用プローブの比較

プローブ名 従来法(CDNB) DNs-Rh
測定方法 UV
(~340 nm)
緑色蛍光
(Ex / Em = 496 / 520 nm)
測定対象 広範なGSTファミリー 広範なGSTファミリー
適用実験 in vitro
(ライセートや精製酵素など)
生細胞実験 イメージング 不可
フローサイトメトリー 不可
測定感度 低い
(UV吸収のため)
高い
(蛍光のため)
ハイスループット性・簡便性 低い
(ライセート調製が必要)
高い
(生細胞のまま観察可能)
非特異的反応
(GST非依存的なGSH反応性)
高い 低い
他の因子との同時測定 不可
(青色や赤色蛍光を併用可能)

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原理詳細

DNs-RhはRhodamine110にGST基質である2,4-dinitrobenzenesulfonamide(DNB)が2つ付加された化合物で,消光状態になっています。GSTによりDNB基がGSH抱合体に変換されると,Rhodamine 110が放出され緑色蛍光(励起/蛍光 = 496 / 520 nm)を発します。DNs-Rhは当初生体内のチオールを検出する試薬として開発されましたが1),その後GST活性の検出試薬として有効であることが分かりました2)。チオールに対する応答性に比べ,GST応答性が著しく強いことから,現在ではDNs-Rhは生細胞用のGST活性測定プローブとして期待されています4)

原理詳細

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参考文献

  1. Shibata, A.,et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 18, 2246-2249 (2008) [PMID:18358719]
    "Rhodamine-based fluorogenic probe for imaging biological thiol."
  2. Alander, J., et al., Anal. Biochem., 390, 52-56 (2009) [PMID:19348782]
    "Characterization of a new fluorogenic substrate for microsomal glutathione transferase 1."
  3. Zhang, J.,et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 14109-14119 (2011) [PMID:21786801]
    "Synthesis and characterization of a series of highly fluorogenic substrates for glutathione transferases, a general stategy."
  4. Shishido, Y., et al.,ChemBioChem., 20(7), 900~905(2019)
    "A covalent inhibitor for Glutathione S-Transferase Pi (GSTP1-1) in human cells."

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特長

  • GST活性によってrhodamine110 が放出され緑色蛍光を生じます(励起/蛍光 = 496 / 520 nm)。
  • 細胞膜透過性を有し,培地に添加するだけで使用できます。
  • さまざまなGSTファミリーに交差性を示します。

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使用例

蛍光スペクトル(反応前後)

GSTP1組換え体(10μg/ml)にDNs-Rh(1μM),GSH(1 mM)を添加し30 分後に,励起光490 nmにおける蛍光スペクトルを測定した。GSH / GSTP1存在時にのみEmmax 520 nm付近の蛍光が観察された。

蛍光スペクトル

in vitroにおけるGST活性測定

GSTP1組換え体(10μg/ml)にDNs-Rh(1μM),GSH(1 mM)を添加して,緑色蛍光強度(Ex / Em 490 / 520 nm)を経時的に観察した。縦軸は1μM Rhodamine 110溶液の蛍光強度を100%とした。GST存在時(GSH(+)/ GST(+))は約30分間で蛍光強度の著しい増加が見られ,プローブの約55%がRhodamineに変換されていたのに対し,GSH(+)/ GST(ー)条件下ではGSHによりわずかな増加が見られたものの,Rhodamineへの変換効率は3%であった。
原理に記載のとおり,DNs-Rhはチオール化合物とわずかに反応します。GST存在時に比べて反応性は著しく小さいものの,数時間オーダーの長時間反応では徐々に蛍光強度が増加する可能性があるため,30~60分程度の反応時間での観察を推奨しています。

生細胞測定

培養細胞におけるGST活性測定

HeLa細胞に2.5μMのDNs-Rhを添加し,30分インキュベート後に蛍光顕微鏡(Ex 480 / Em535 nm)を用いて観察した。1 mMの不可逆的阻害物質CNBSF(#FDV-0031)を前処理として加え,15分間反応させた。DNs-Rhにより細胞内からRhodamine 110の緑色蛍光が観察されたが,阻害物質CNBSFで前処理した場合は,著しく蛍光強度が減少していることが分かる。
イメージングにおける注意点:本試薬ではGSTにより放出されたrhodamine 110の細胞内分布を観察しています。蛍光強度をもとにGSTの相対活性強度を観察することができますが,GSTの細胞内局在を可視化するものではありませんのでご留意下さい。

培養細胞

フローサイトメトリーによるGST活性の定量

左:K562細胞に2.5μMのDNs-Rhを添加し,5,60,180分後にフローサイトメトリーで測定(Ex / Em = 488 / 525 nm)した。時間依存的な蛍光強度の増加が観察された。
右:K562細胞とHL60細胞に2.5μMのDNs-Rhを添加し,60分後にフローサイトメトリーで測定(Ex / Em = 488 / 525 nm)した。HL60細胞の方がK562細胞よりも1細胞あたりのGST活性が高いことが分かる。

フローサイト

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価格

[在庫・価格 :2019年07月22日 17時51分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
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  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数 リスト
DNs-Rh <Cell-based GST Activity Assay Reagent>
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説明文
Glutathione S-transferase(GST)の酵素活性を生細胞で観察することができる蛍光プローブ。GST活性に応じて緑色の蛍光が発生するため,細胞内GSTの活性評価に有用。広範なGSTサブファミリーに交差するため,総GST活性を可視化できる。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
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DNs-Rh <Cell-based GST Activity Assay Reagent>

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  • 商品コード:FDV-0030
  • メーカー:FNA
  • 包装:0.1μmol
  • 価格:¥30,000
  • 在庫:3個以上
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説明文 Glutathione S-transferase(GST)の酵素活性を生細胞で観察することができる蛍光プローブ。GST活性に応じて緑色の蛍光が発生するため,細胞内GSTの活性評価に有用。広範なGSTサブファミリーに交差するため,総GST活性を可視化できる。
法規制等
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reagent@funakoshi.co.jp

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