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酸化ストレスマーカーアクロレインを細胞レベルで検出する試薬 AcroleinRED ®(Cell-based Acrolein Detection Reagent)

掲載日情報:2019/01/29 現在Webページ番号:67942

フナコシ /
フナコシ株式会社
[メーカー略称:FNA]

アクロレインを細胞レベルで検出する試薬 AcroleinREDロゴ

強力な毒性を示す不飽和アルデヒド、アクロレイン(acrolein)と特異的に反応し、赤色蛍光で可視化する試薬です。他の不飽和アルデヒドや脂質代謝物等には反応せず、内因性のアクロレインまたは外部刺激依存的に過剰産生されるアクロレインを生細胞で簡便に検出、相対定量することができます。
本製品は理化学研究所 開拓研究本部 田中生体機能合成化学研究室の研究成果をもとに、フナコシ(株)が製品化し、販売しています。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


AcroleinREDを用いたイメージングによる培養細胞および乳がん組織の検出例A
AcroleinREDを用いたイメージングによる培養細胞および乳がん組織の検出例B

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AcroleinRED®を用いたイメージングによる培養細胞および乳がん組織の検出例

AcroleinRED®は細胞内および細胞表面でアクロレインと特異的に反応し、直ちに近傍の生体分子に無作為に反応することで赤色色素を細胞に繋ぎ留めます。細胞・組織レベルでのアクロレインの検出に有用です。

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アクロレインとは?

アクロレイン(Acrolein; 2-propenal)は最も単純な構造のα,β-不飽和アルデヒドで、その化学的反応性の高さから細胞の酸化ストレスマーカーとして近年注目されています。アクロレインの発生源は幅広く、環境的な要因と生理的な要因に分けられます。環境的な要因としてはたとえば食物を料理する際(特に肉や魚を油で揚げる、焼いて焦げる際など)に発生、飲酒、タバコの煙、排気ガス(有機物を焼却)などが知られています。一方、生理的な要因として、生体内でも盛んに代謝副産物として合成されており、脂質過酸化反応、酵素依存的なスレオニン・メチオニンの代謝やポリアミンの酸化、さらには細胞が酸化ストレスに曝されることで発生することが報告されています。また、がんやアルツハイマー、脳梗塞など、酸化ストレスを原因とする疾患においても細胞にアクロレインが過剰に発生し、さらに酸化ストレスを亢進させると考えられています。

acrolein構造式

アクロレインの構造式

アクロレインは化学的反応活性が非常に高く、生体内のさまざまな求核基(タンパク質、核酸や脂質など)に付加し、無差別に機能を破壊することから、強力な毒性を示す酸化ストレスマーカーとして認知され始めています。近年の研究では、最も有名な酸化ストレスマーカーである活性化酸素種(Reactive Oxidative species;ROS)よりも毒性が高いことが明らかにされ、アクロレインは基礎生物学のみならず、創薬、環境科学、食品業界、健康産業など幅広いライフサイエンス分野で注目される因子です。しかしながら、アクロレインの単純構造、高い反応活性ゆえに検出が難しく、十分な解析が進められていませんでした。

従来のアクロレインの検出方法

従来法では、アクロレインそのものの検出は難しく、アクロレインのα,β-不飽和アルデヒド構造を利用した化学反応物の検出がメインにおこなわれています。ここでは代表的な2つの方法を示します。

⑴ FDPの検出

従来のアクロレインの検出方法1

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アクロレインは生体内でタンパク質のアミンと緩やかに反応し、3-formyl-3,4-dehydropiperidine(FDP)を生成します。このFDPを認識する抗体を用いることで、間接的にアクロレインを検出・定量する方法が広く用いられています。しかしながら、①FDPは多数あるアクロレインの反応物の一種でしかないことから、抗FDP抗体によるアクロレインの評価は不十分、②FDPの生成が遅いため、アクロレインの生成を感度よく見ているとはいえない、といった懸念点も挙げられています。また、抗体を用いるため、生細胞実験には向かないという課題もあります。

⑵ HPLCによる検出

従来のアクロレインの検出方法2

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アクロレインと選択的に反応し蛍光を発する化合物3-aminopropanolを前処理し、蛍光性の生成物7-hydroxyquinolineをHPLCで蛍光分析することで定量する方法が確立されています。しかしながらアクロレインの高い反応性や揮発性が原因で簡単に単離できない、生成物の蛍光感度が低い、ロースループット、細胞破砕が不可欠で、生細胞のアクロレイン量は調べられないといった問題点が挙げられています。

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AcroleinRED®の原理

AcroleinRED®は理化学研究所田中克典主任研究員らが発見したフェニルアジドとアクロレインの特異的な環化反応を利用した試薬です。

フェニルアジドのアクロレイン特異的な反応

フェニルアジド基はアクロレインと特異的かつ迅速に反応し、環状生成物4-formyl-1,2,3-triazolineを生成します。4-formyl-1,2,3-triazolineは、近傍の生体分子と非特異に反応し共有結合を形成します。

アクロレイン特異的な反応

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AcroleinRED®によるアクロレインの検出原理

AcroleinRED®によるアクロレインの検出原理は細胞内外の2つの経路が考えられています。

AcroleinRED によるアクロレインの検出原理

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  • ⓵ 細胞内アクロレインの検出
    AcroleinRED®は膜透過性を有するため、細胞膜を透過し、細胞内でアクロレインと反応し、4-formyl-1,2,3-triazolineを形成します。
  • ⓶ 細胞外に放出されたアクロレインの検出
    細胞膜の脂質過酸化反応により産生するアクロレインは細胞外へ放出されています。アクロレインは細胞外で速やかにAcroleinRED®と反応し、反応生成物4-formyl-1,2,3-triazolineはエンドサイトーシス経路に取り込まれます。

⓵、⓶いずれの経路でも反応生成物である4-formyl-1,2,3-triazolineは、細胞内で無作為に生体分子(タンパク質など)と反応し、細胞内に繋留されることで細胞を染色します。
アクロレインと試薬の反応生成物および生体分子に付加した状態が蛍光シグナルとして検出されるため、アクロレインの局在を可視化するものではありません。本試薬では局在観察はできませんのでご留意下さい。

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特長

  • AcroleinRED®はフェニルアジドがアクロレインと特異的かつ迅速に反応することを利用した試薬です。細胞から産生されたアクロレインにTAMRAを標識することで、アクロレインを可視化することができます。
  • ローダミンのフィルターセットで観察できます(励起/蛍光波長:560 nm/585 nm)
  • 他の不飽和アルデヒド(crotonaldehyde、trans-2-octenal、methacrolein)、スチレンには反応しません。
  • 前処理不要かつ簡便な操作で検出できます。
  • 既存のアクロレイン定量法に比べて高い感度を示します。(アクロレイン検出限界:100 nM)
  • 蛍光強度でアクロレイン量を相対定量することができます。

AcroleinRED®の吸収スペクトルと蛍光スペクトル

PBS中におけるAcroleinREDの吸収スペクトル(点線)と蛍光スペクトル(実線)

PBS中におけるAcroleinRED®の吸収スペクトル(点線)と蛍光スペクトル(実線)

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アプリケーション

  • 定常状態でのアクロレイン産生量の相対定量
  • 外部刺激(薬剤処理など)によるアクロレイン産生量の変動を相対定量

アクロレインの局在観察には使用できません。詳しくはAcroleinRED®の原理をご覧下さい。

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操作法概略

AcroleinREDのワークフロー

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AcroleinRED®のワークフロー

  1. フレッシュな培地を用いてAcroleinRED®溶液(終濃度10~30μM)を調製する。
    終濃度は細胞種によって異なる可能性がありますので、実験に応じて最適化を推奨いたします。
  2. 培養細胞の培地を除去し、PBSで2回洗浄する。
  3. AcroleinRED®含有培地を添加する。
  4. 30分~1時間培養する。
    処理時間を長くすることで、シグナルが蓄積します。反応時間は実験系に応じて最適化して下さい。
  5. 細胞をPBSで3回洗浄し、新しい培地を添加する。
  6. 非固定(生細胞)、固定細胞いずれも観察可能です。

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データ例

フェニルアジドのアクロレイン特異性検証

検出試薬

phenylazide    

phenylazide
ターゲット

acrolein

acrolein

methacrolein

methacrolein

crotonaldehyde

crotonaldehyde

trans-2-octenal

trans-2-octenal

styrene

styrene
反応効率 47% <1% <1% <1% <1%

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酸化ストレス依存的なアクロレイン産生量の増加

酸化ストレスモデルとして、HUVEC細胞に過酸化水素(H2O2)を0~1,000μMの各濃度で添加し2時間プレインキュベートした後、AcroleinRED®を添加して30分後に非固定で観察した。H2O2を無添加時は定常状態のアクロレイン産生量を観察できる。また、H2O2の濃度に依存して、アクロレイン産生量が増加していることがわかる。

酸化ストレス依存的なアクロレイン産生量の増加(蛍光染色像)

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酸化ストレス依存的なアクロレイン産生量の増加(蛍光強度)

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ROS産生促進試薬によるアクロレイン産生量の増加

HUVEC細胞を細胞内の活性化酸素(ROS)産生を促進する物質Menadioneで0、10、30、60分間処理した後、それぞれROS検出試薬およびAcroleinRED®で共染色した。Menadione処理によりROSは迅速に増加したのに対し、アクロレインは遅れて増加することが観察された。

ROS産生促進試薬によるアクロレイン産生量の比較写真

ROS産生促進試薬によるアクロレイン産生量の比較写真

ROS産生促進試薬によるアクロレイン産生量増加の比較グラフ

ROS産生促進試薬によるアクロレイン産生量増加の比較グラフ

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細胞種ごとのアクロレイン産生量の比較

ヒト正常細胞3種類およびヒトがん細胞株8種類について、AcroleinRED®によりアクロレイン産生量の相対比較を行った。正常細胞に比べ、がん細胞でアクロレイン産生量が有意に増加していることが分かる。また、本試薬を用いることで、がん細胞の種類ごとにアクロレイン産生量に差があることが明らかになった。

細胞種ごとのアクロレイン産生量の比較写真

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細胞種ごとのアクロレイン産生量の比較写真

細胞種ごとのアクロレイン産生量の比較グラフ

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細胞種ごとのアクロレイン産生量の比較グラフ

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組織中のアクロレインの可視化

組織中のアクロレインの可視化

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乳がん患者由来の乳腺組織(IDC; invasive ductal carcinoma, DCIS; ductal carcinoma in situ)および健常乳腺組織(NBG; normal breast gland)を摘出直後に非固定の状態でAcroleinRED®(20μM)/ Hoechst混合溶液に浸し、5分間静置しアクロレイン・細胞核を染色した。組織を洗浄後に蛍光顕微鏡で観察を行った。AcroleinRED®により乳がん組織(IDC, DCIS)では赤色蛍光が観察されている一方で、正常乳腺組織(NBG)ではAcroleinRED®による染色はほとんど観察されなかった。このように、非固定状態の抽出組織を本試薬で染色することが可能である。

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原著論文

  • A. R. Pradipta, M. Taichi, I. Nakase, E. Saigitbatalova, A. Kurbangalieva, S. Kitazume, N. Taniguchi, K. Tanaka, ACS Sens., 1, 623~632 (2016).
    Uncatalyzed Click Reaction between Phenyl Azides and Acrolein: 4-Formyl-1,2,3-Triazolines as “Clicked” Markers for Visualizations of Extracellular Acrolein Released from Oxidatively Stressed Cells.
  • T. Tanei, A. R. Pradipta, K. Morimoto, M. Fujii, M. Arata, A. Ito, M. Yoshida, E. Saigitbatalova, A. Kurbangalieva, J. Ikeda, E. Morii, S. Noguchi, and K. Tanaka, Adv. Sci., 1801479 (2018)
    Cascade reaction in human live tissue allows clinically applicable diagnosis of breast cancer morphology. [PMID:30693189]

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AcroleinRED <Cell-based Acrolein Detection Reagent>
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強力な毒性を示す不飽和アルデヒド,アクロレイン(acrolein)と特異的に反応し,赤色蛍光で可視化する試薬。他の不飽和アルデヒドや脂質代謝物等には反応せず,内因性のアクロレインまたは外部刺激依存的に過剰産生されるアクロレインを生細胞で簡便に検出,相対定量することができる。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2023年8月合併号 p.30
ニュース2022年11月15日号 p.19

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AcroleinRED <Cell-based Acrolein Detection Reagent>

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説明文 強力な毒性を示す不飽和アルデヒド,アクロレイン(acrolein)と特異的に反応し,赤色蛍光で可視化する試薬。他の不飽和アルデヒドや脂質代謝物等には反応せず,内因性のアクロレインまたは外部刺激依存的に過剰産生されるアクロレインを生細胞で簡便に検出,相対定量することができる。
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掲載カタログ ニュース2023年8月合併号 p.30
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(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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