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マルチプレックス免疫蛍光法に最適ながん関連抗体パネル Multiplex Assay PathPlex Panelシリーズ

掲載日情報:2022/05/13 現在Webページ番号:64942

Bethyl Laboratories社のPathPlex Panelは,免疫組織染色(IHC)での使用が検証済みの抗体が3~6種類ずつセットになっており,マルチプレックスフォーマットで利用でき,特にTSAベースのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイに最適です。腫瘍内微小環境をプロファイルするのに有用です。
45年以上の経験を持つBethyl Laboratories社は,世界中の研究者から信頼される抗体メーカーとして認識されています。


がん微小環境TME protein

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がん微小環境関連タンパク質

("The Scientist"より転載 The document belongs to "The Scientist".)

チラミドシグナル増幅(TSA)ベースのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイとは

マルチプレックス免疫蛍光(mIF,multiplex immunofluorescent)アッセイとは

多重免疫蛍光(mIF,multiplex immunofluorescent)アッセイは,1枚のスライドで同時に視覚化できるバイオマーカーの数を増やし,バイオマーカーの発現レベルに関する情報を得る方法です。この方法は,試料を節約しながら組織の微小環境に関するより良い情報が得られるといった利点があります。

このmIFにおいて,チラミドシグナル増幅(TSA,Tyramide signal amplification)を利用することにより,同一種の抗体ができたり,低発現量のタンパク質での検出が可能になります。mIFにおいてチラミドによるシグナル増幅では,蛍光色素を西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体を使用して組織に共有結合させます。目的タンパク質の部位に相当量のフルオロフォア標識チラミドが沈着した結果,蛍光色素の密度が高くなり,強いシグナルが得られます。

多重免疫蛍光(mIF,multiplex immunofluorescent)アッセイの原理

マルチプレックス免疫蛍光法サイクル

mIFアッセイでは,まず一つ目の標的タンパク質に対応する一次および二次抗体が沈着する。続けて加熱洗浄(抗原賦活化)によって抗体を組織から除去し,二つ目の標的タンパク質に対して蛍光標識するというプロセスを繰り返し,最終的にすべての標的タンパク質を標識するまでこのプロセスを繰り返す。イメージングの前にDAPIで対比染色を行い,カバースリップで封入する。

マルチプレックス免疫蛍光(mIF,multiplex immunofluorescent)アッセイのガイドライン

mIFアッセイにおけるS/N比の低下を抑制して良好な結果を得るためには,目的の各タンパク質に対する蛍光抗体法で検証済みの最高品質の抗体を使用する必要があります。また,組織の自家蛍光の影響,タンパク質量の不足,不十分なブロッキング・洗浄,不適切な一次抗体と二次抗体の濃度など,様々な要因をクリアする必要があります。これらの要因を克服するためには,以下の4項目を最適化する必要があります。

実施例

  • 一次抗体:CD3e, CD8, CD20, CD68,PD-L1
  • 検出システム:Opal

1. 一次抗体濃度の最適化

S/N比の最適化のため,適切な一次抗体の希釈率を決定する必要があります。一次抗体濃度の最適化の要件は以下の通りです。

  • (1)DABにより検出した抗体の染色パターンの認識
  • (2)TSA基質を使用したシグナルの最適化。
高いS/N比がmIFアッセイにおける成功に必須となる

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高いS/N比がmIFアッセイにおける成功に必須となる

左図の例では,1:500~1:1,000の希釈率において許容範囲のパラメーターとなり,1:750の希釈率において最適なS/N比(10:1)が得られています。1:250の希釈率では,より高いシグナル強度が得られていいますが,対応するS/N比(1.5:1)は許容範囲に入っていません。一方で,1:1,250以上の希釈率では,シグナル強度が十分得られていません。
マルチプレックスで使用する一次抗体ごとに,こうした最適化プロセスを行なうことが重要となります。

2. 蛍光色素と抗体の組み合わせの最適化

それぞれのタンパク質に対応するシグナルと他のタンパク質のシグナルとの区別が可能で,チャネル間(それぞれのチャネルは,特定の一次抗体に1つの色が適応し,それに応じた1つのフィルターセットで構成される)に重複が認められない場合において最適な結果が得られます。あるチャネルのシグナルが非常に高い場合に,近接するチャネルにおいてシグナルの重複により別のタンパク質の検出ができなくなる場合があるため,これは非常に重要です。したがって,十分なS/N比が得られる一次抗体と蛍光色素間の正しいペアリングを決定する必要があります。

蛍光色素と一次抗体の正しいペアリングを行うことにより,存在量の異なるタンパク質間のシグナルのバランスを取る手助けとなる

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蛍光色素と一次抗体の正しいペアリングを行うことにより,存在量の異なるタンパク質間のシグナルのバランスを取る手助けとなる

左図の例では,蛍光色素のOpal 620が最適なS/N比で強いシグナルを示しています。Opal 480および520も強いシグナルを示していますが,組織の自家蛍光による固有のノイズが高くなっています。発現量の低いタンパク質を検出する場合では,ほとんどの場合においてイメージングシステムで検出する蛍光色素の能力と,その蛍光色素のイメージングに使用するフィルターセットで観察される組織の自家蛍光とのバランスを取る必要があります。

3. Opal濃度

基質が多すぎると,組織に余剰な蛍光色素が沈着し,過剰なバックグラウンドが生じる可能性があります。

Opal濃度の最適化によりバックグラウンドを低減し,シグナルのバランスを取ることができる

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Opal濃度の最適化によりバックグラウンドを低減し,シグナルのバランスを取ることができる

上図の例では,1:250の希釈率で最高のS/N比が得られている。近接チャネルで画像化するタンパク質の検出のバランスをとるためシグナルを低減する必要がある場合,1:500の希釈率がより望ましい場合もあります。

4. 標的染色の順序の最適化

検出システムにTSAを使用するmIFのプロセスでは,連続的な染色が必要で,すべての標的タンパク質が検出されるまで抗体の結合,蛍光色素の沈着,および抗体の除去を繰り返します。組織を加熱抗原賦活化法(Heat-Induced Epitope Retrieval,HIER)で処理すると,エピトープの分解や増強を引き起こすおそれがあります。HIERの連続処理が個々のエピトープにどのように影響を及ぼすかを予測することは不可能です。したがって,最良の結果を得るために,染色の順序を決定することが重要となります。

染色順序の最適化には,上記のガイドラインに従って決定した最適な抗体濃度および蛍光色素/抗体比において,検出するエピトープの数と同数のHIERの連続処理をシングルプレックス染色で実行します。

明瞭なシグナルと存在しないシグナルとで,正しい染色の順番に違いがある場合がある

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明瞭なシグナルと存在しないシグナル間で,正しい染色の順番に違いがが生じる場合がある

左図の例では,染色の順序を選択する方法の例を示しています。

7種類の標的タンパク質に対してマルチプレックスアッセイを行って3番目の位置で染色される抗体を決定するためには,まず2回のHIER操作を,次にシングルプレックス染色,その後4回のHIER操作を実施します。

Antibody 1は,2回目の抗原回復後にシグナルの低下を示しています。したがって,その後の染色ではシグナルが低くなりすぎることから,Antibody 1は最初の2サイクルまでに使用を限定する必要があります。対照的に,Antibody 2では染色サイクルを通してHIERの影響がわずかなために,7回の染色サイクルを通して使用が可能であることがわかります。



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製品ラインナップ

各パネルには,各抗体が100μl(約50テスト分)ずつセットになっています。品名をクリックすると各製品の使用例,商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

品名 PathPlex
Panel 1 Panel 2 Panel 3 Panel 4 Panel 5 Panel 6 Panel 7 Panel 8
セット内容 商品コード A810-001 A810-002 A810-003 A810-004 A810-005 A810-006 A810-007 A810-008
CD3E抗体 A700-016
CD4抗体 A700-015
CD8α抗体 A700-044
CD20抗体 A500-017A
CD45RO抗体 A500-020
CD68抗体 A500-018A
Cytokeratin抗体 A500-019A
FOXP3抗体 A700-034
Granzyme B抗体 A700-022
Ki-67抗体 A700-021
LAG3抗体 A700-027
PD-L1抗体 A700-020
SOX10抗体 A700-080


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使用例

PathPlex Panel 1(#A810-001)によるヒトCD3E,CD8α,およびPD-L1の検出

PathPlex Panel 1(#A810-001)によるヒトCD3E,CD8α,およびPD-L1の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)乳がん組織
  • 一次抗体:抗CD3E抗体(#A700-016オレンジ色),抗CD8α抗体(#A700-044赤色),抗PD-L1抗体(#A700-020緑色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P
  • 基質:Opal 520,620,690
  • 対比染色:DAPI(青色

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PathPlex Panel 2(#A810-002)によるヒトCD3E,CD8α,およびCD20の検出

PathPlex Panel 2(#A810-002)によるヒトCD3E,CD8α赤色,およびCD20(の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)扁桃腺組織
  • 一次抗体:抗CD3E抗体(#A700-016黄色),抗CD8α抗体(#A700-044赤色),抗CD20抗体(#A500-017A緑色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P),HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(#A90-116P
  • 基質:Opal 520,620,690
  • 対比染色:DAPI(青色

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PathPlex Panel 3(#A810-003)によるヒトCD3E,CD68,およびCD20の検出

PathPlex Panel 3(#A810-003)によるヒトCD3E,CD68,およびCD20の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)肺がん組織
  • 一次抗体:抗CD3E抗体(#A700-016黄色),抗CD68抗体(#A500-018A赤色),抗CD20抗体(#A500-017A緑色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P),HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(#A90-116P
  • 基質:Opal 520,620,690
  • 対比染色:DAPI(青色

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PathPlex Panel 4(#A810-004)によるヒトCD3E,CD8,CD68,サイトケラチン,FOXP3およびPD-L1の検出

PathPlex Panel 4(#A810-004)によるヒトCD3E,,CD8,CD68,サイトケラチン,FOXP3およびPD-L1の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)扁桃腺組織
  • 一次抗体:抗CD3E抗体(#A700-016オレンジ色),抗CD8抗体(#A700-044シアン色),抗CD68抗体(#A500-018緑色),抗サイトケラチン抗体(#A500-019A黄色),抗FOXP3抗体(#A700-034赤色),抗PD-L1抗体(#A700-020マゼンタ色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P),HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(#A90-116P
  • 基質:Opal 480,520,570,620,690,780
  • 対比染色:DAPI(青色

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PathPlex Panel 5(#A810-005)によるヒトCD3E,CD8,CD68,サイトケラチン,Ki67およびPD-L1の検出

PathPlex Panel 5(#A810-005)によるヒトCD3E,,CD8,CD68,サイトケラチン,Ki67およびPD-L1の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)頭頸部扁平上皮がん組織(HNSCC)
  • 一次抗体:抗CD3E抗体(#A700-016シアン色),抗CD8抗体(#A700-044緑色),抗CD68抗体(#A500-018オレンジ色),抗サイトケラチン抗体(#A500-019A赤色),抗Ki-67抗体(#A700-021黄色),抗PD-L1抗体(#A700-020白色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P),HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(#A90-116P
  • 基質:Opal 480,520,570,620,690,780
  • 対比染色:DAPI(青色

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PathPlex Panel 6(#A810-006)によるヒトCD3E,CD8,サイトケラチン,グランザイム B,Ki-67,およびSOX10の検出

PathPlex Panel 6(#A810-006)によるヒトCD3E,,CD8,CD68,サイトケラチン,Ki67およびPD-L1の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)乳がん組織(HNSCC)
  • 一次抗体:抗CD3E抗体(#A700-016シアン色),抗CD8抗体(#A700-044赤色),抗サイトケラチン抗体(#A500-019A黄色),抗グランザイム B抗体(#A700-022緑色),抗Ki-67抗体(#A700-021オレンジ色),抗SOX10抗体(#A700-080マゼンタ色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P),HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(#A90-116P
  • 基質:Opal 480,520,570,620,690,780
  • 対比染色:DAPI(青色

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PathPlex Panel 7(#A810-007)によるヒトCD4,CD8,CD45RO,サイトケラチン,およびFOXP3の検出

PathPlex Panel 7(#A810-007)によるヒトCD4,CD8,CD45RO,サイトケラチン,Ki67およびFOXP3の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)扁桃腺組織
  • 一次抗体:抗CD4抗体(#A700-015オレンジ色),抗CD8抗体(#A700-044シアン色),抗CD45RO抗体(#A500-020赤色),抗サイトケラチン抗体(#A500-019A黄色),抗FOXP3抗体(#A700-034緑色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P),HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(#A90-116P
  • 基質:Opal 480,520,570,620,690,780
  • 対比染色:DAPI(青色

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PathPlex Panel 8(#A810-008)によるヒトCD3E,CD4,CD8,サイトケラチン,FOXP3,およびLAG3の検出

PathPlex Panel 8(#A810-008)によるヒトCD3E,CD4,CD8,サイトケラチン,FOXP3およびLAG3の検出

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  • 試料:ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)扁桃腺組織
  • 一次抗体:抗CD3E抗体(#A700-016シアン色),抗CD4抗体(#A700-015オレンジ色),抗CD8抗体(#A700-044赤色),抗サイトケラチン抗体(#A500-019A黄色),抗FOXP3抗体(#A700-034マゼンタ色),抗LAG3抗体(#A700-027緑色
  • 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ウサギIgG抗体(#A120-501P),HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(#A90-116P
  • 基質:Opal 480,520,570,620,690,780
  • 対比染色:DAPI(青色

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mIFアッセイの操作手順(ホルマリン固定,パラフィン包埋組織および細胞ブロック)

上記のマルチプレックス免疫蛍光アッセイで重要な4要素の最適化を実施後に,以下のプロトコルによって3つ以上の標的タンパク質に対するmIFアッセイを実施できます。 帯電コート処理済みのスライドに3~5μmのパラフィン切片を使用することをお勧めします。

1. 必要な試薬

  • キシレン
  • 組織染色グレード純エタノール
  • 内在性ペルオキシダーゼブロック液:0.9%過酸化水素(メタノール溶液)
  • 抗原賦活化溶液
  • クエン酸バッファー(トリス-クエン酸ナトリウム(無水)2.94 g/L dH2O,pH6.0)
  • トリスバッファー(トリス塩基1.21 g+EDTA 0.37g/L dH2O,pH9.0)
  • 1×トリス緩衝食塩水(TBS),0.1% Tween 20(TBST)
  • ブロッキング溶液:20%正常ヤギ血清/PBS
  • IHC抗体希釈液:1%BSA(50 mM TBS)
  • HRP標識二次抗体:抗マウス(#A90-116P),抗ウサギ(#A120-501P
  • 蛍光色素結合Tyramide Signal Amplification(TSA)
  • DAPI核対比染色試薬
  • スライド封入剤

2. スライドの調製

  1. キシレン:5分ごとに3回交換する。上下に10回撹拌する。
  2. 純エタノール:5分ごとに3回交換する。上下に10回撹拌する。
  3. 0.9%過酸化水素(メタノール溶液)に40分間浸漬する。上下に10回撹拌する。
  4. 蒸留水で5分間2回洗浄する。上下に10回撹拌する。
  5. 抗原賦活化(推奨バッファーは製品データシートを参照)。抗原賦活化溶液を92~96℃まで加熱する。スライドを抗原賦活化溶液に浸漬し,20分間静置する。机上で20分間冷却する。次に,抗原賦活化溶液を除去し,蒸留水を容器に添加する。
  6. 撥水ペンを用いて組織を疎水性の円で囲う。試料が乾燥しないように注意する。

3. 染色サイクル

1回目のサイクル(一つ目の標的タンパク質)

  1. ブロッキング:20% 正常ヤギ血清または二次抗体の宿主に適合する正常血清中で組織を20分間,室温でインキュベートする。
  2. 一次抗体:ブロッキングバッファーを除去し,IHC抗体希釈液で希釈した一次抗体を添加する(推奨の希釈範囲は,製品データシートを参照。最適希釈率は,実験により決定。)。室温で20分間インキュベートする。
  3. 洗浄:TBSTを用いて5分間の洗浄を3回繰り返す。上下に10回撹拌する。
  4. HRP標識二次抗体:1:400に希釈したHRP標識二次抗体(ヤギ抗ウサギ抗体:#A120-501Pまたはヤギ抗マウス抗体:#A90-116P)を添加し,室温で20分間インキュベートする。
  5. 洗浄:TBSTを用いて5分間の洗浄を3回繰り返す。上下に10回撹拌する。
  6. TSA基質:蛍光色素結合を希釈し,メーカーの指示に従ってインキュベートする。
  7. 洗浄:TBSTを用いて5分間の洗浄を3回繰り返す。上下に10回攪拌する。
  8. 抗原賦活化:次のサイクルに向けて,一次抗体の推奨バッファー(製品データシート参照)を用いて抗原賦活化をもう一回繰り返す(ステップ#5を参照)。

二つ目のサイクル(2番目の標的タンパク質)

  1. ブロッキング:20% 正常ヤギ血清または二次抗体の宿主に適合する正常血清中で組織を20分間,室温でインキュベートする。
  2. 一次抗体:ブロッキングバッファーを除去し,IHC用抗体希釈液で希釈した一次抗体を添加する(推奨の希釈範囲は,製品データシートを参照。最適希釈率は,実験により決定)。室温で20分間インキュベートする。
  3. 洗浄:TBSTを用いて5分間の洗浄を3回繰り返す。上下に10回撹拌する。
  4. HRP標識二次抗体:1:400に希釈したHRP標識二次抗体(ヤギ抗ウサギ抗体:#A120-501Pまたはヤギ抗マウス抗体:#A90-116P)を添加し,室温で20分間インキュベートする。
  5. 洗浄:TBSTを用いて5分間の洗浄を3回繰り返す。上下に10回撹拌する。
  6. TSA基質:蛍光色素結合を希釈し,メーカーの指示に従ってインキュベートする。
  7. 洗浄:TBSTを用いて5分間の洗浄を3回繰り返す。上下に10回攪拌する。
  8. 抗原賦活化:次のサイクルに向けて,一次抗体の推奨バッファー(製品データシート参照)を用いて抗原賦活化をもう一回繰り返す(ステップ#5を参照)。

3~8回目のサイクル

  1. マルチプレックスアッセイに用いる標的タンパク質の数に応じて,ステップ15~22を最大8回まで繰り返す。

対比染色および封入

  1. スライドを蒸留水で洗浄する。
  2. スライドをTBSTで洗浄する。
  3. 使用するDAPI製品のプロトコルに従ってDAPI溶液中でスライドをインキュべートする。
  4. TBSTで5分間スライドを洗浄する。
  5. 蒸留水中で5分間スライドを洗浄する。
  6. 適切な封入剤で封入する。

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mIF検出における推奨のイメージングシステム

マルチプレックス免疫蛍光法では,標準的な落射蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡複数のシステムなどを用いて画像処理を行うことができますが,特に組織切片全体を画像化する機能と自動制御化が可能な蛍光スライドスキャナーの使用を推奨します。蛍光色素が重複するスペクトルを有するためにフィルターで完全に解離できない場合は,何らかのマルチスペクトル画像処理が必要となります。
イメージングシステムのタイプは,標的タンパク質の数と蛍光色素の組み合わせにおける重複の有無により異なります。マルチプレックス用のイメージングシステムの代表例を以下に示します。

・3色以下(抗体2種+DAPI)

  • 標準的な研究グレードの蛍光顕微鏡
  • 共焦点顕微鏡
  • Mantra
  • Aperio Versa社 スライドスキャナー
  • Zeiss社 Axioscan
  • 3DHisTech社 パノラマスライドスキャナー
  • Vectra, Vectra 3, Vectra Polaris

・4色以上(抗体3種+DAPI)

  • 共焦点顕微鏡
  • Mantra
  • Aperio Versa社 スライドスキャナー
  • Zeiss社 Axioscan
  • 3DHisTech社 パノラマ 250 スライドスキャナー
  • Vectra, Vectra 3, Vectra Polaris

・スペクトルが重複する蛍光色素

  • 高機能共焦点顕微鏡
  • Mantra
  • Vectra, Vectra 3, Vectra Polaris

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mIF検出に関するトラブルシューティングガイド

1. シグナルが弱すぎる場合

  • DABでの検出により抗体がIHCに適切であることを検証する。
  • TSA基質を用いて一次抗体の力価を測定する。
  • 二次抗体の濃度を上げる。
  • TSA基質の濃度を上げる。
  • TSA基質のインキュベーション時間を延ばす。
  • 異なるHIER法を試験する。
  • 既知の陽性組織で一次抗体を試験する。
  • 再度,抗体の使用する順序を最適化する。

2. シグナルが強すぎる場合

  • TSA基質を用いて一次抗体の力価を測定する。
  • 二次抗体の濃度を下げる。
  • TSA基質の濃度を下げる。
  • TSA基質のインキュベーション時間を短縮する。

3. バックグラウンドが高すぎる場合

  • 染色の前にペルオキシダーゼのブロッキングを行う。
  • 抗体の力価を測定する。
  • 洗浄の時間と回数を増やす。
  • 粒子が組織に接触しないように,すべてのバッファーをろ過する。
  • ブロッキングバッファーを別のものに変更する。

4.組織上の蛍光スペクトルや微粒子によりTSAシグナルが過剰な場合

  • 洗浄時間を延長する。
  • スライドをより激しく洗浄する。
  • TSA基質を希釈する。
  • HRP標識二次抗体を希釈する。

5.特定の抗原シグナルが他の抗原シグナルと重なる場合

  • 次の染色サイクルを始める前に,HIER法により抗体を確実に除去する。
  • 各蛍光色素に対して適切なフィルターを使用してイメージングを実施する。
  • 蛍光色素のスペクトルが重複する場合は,マルチスペクトルイメージングを行う。

6.組織の自己蛍光が伴う場合

  • マルチスペクトルイメージングを行う。
  • 蛍光色素のスペクトルを緑色から赤色領域にシフトする。

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mIF検出に関するFAQ

Q-1. mIFを開始するに当たって何が必要となりますか?

A-1. mIFを始めるには,高品質のIHC検証済み一次抗体,HRP標識二次抗体,チラミド検出蛍光色素,およびアッセイで使用されている蛍光色素を解析できるイメージングシステムが必要です。

Q-2. どのような一次抗体でも使用できますか?

A-2. 抗体が同じ免疫動物種に由来する場合であっても,任意の免疫動物種の一次抗体をmIFで使用することができます。Bethyl社のIHC検証済み抗体,または高度に検証されたIHC抗体を使用してmIFを開始することをお勧めします。他社の抗体を使用する場合には,使用前に十分な検証を行って下さい。

Q-3. どのような種類の試料が必要ですか?

A-3. 最も一般的なmIFの試料は,ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)です。チラミド検出を用いたmIFでは,複数回のHIERを行うため,FFPE組織以外ではアッセイ中に分解する傾向があります。

Q-4. チラミド検出蛍光色素はどこで購入できますか?

A-4. Bethyl社の抗体は,Akoya Biosciences社のOpal検出システムを使用しmIFに対して検証を行っています。他のチラミド試薬を使用する場合には,使用前に十分な検証を行って下さい。

Q-5. 最適化操作を実行する必要はありますか?

A-5. mIFプロトコルでは,基本的な最適化パラメーターの概要を示しています。アプリケーションで示した推奨事項は,アッセイ法開発の起点であり,それぞれの組織を使用して抗体をさらに最適化する必要があります。組織の固定,抗原賦活化バッファー,抗原賦活化に使用する機器,および技術的熟練度の違いによってmIFアッセイに影響する可能性があります。

Q-6. シングルプレックス染色ではシグナルを検出できても,マルチプレックス染色ではシグナルを検出できないことがあるのはなぜですか?

A-6. 染色の順番は,抗原の検出に影響を与える可能性があります。複数回の抗原賦活化によって一部のエピトープが破壊される可能性があります。この場合,これらのマーカーを認識する抗体は,染色の順番の早い段階で使用する必要があります。Bethyl社の検証済みのmIF Panelは,染色の順番について,最初にお試しいただくものを確立しています。この順番は,mIFアッセイを実際に行われる前に,ご自身の組織で検証していただく必要があります。

Q-7. 組織内の同じ細胞タイプに局在する抗原に関しての推奨する事項はありますか?

A-7. 同じ細胞タイプで発現しているマーカーを染色する場合で,特にそれらのマーカーが同じ細胞内の位置に局在している場合では,蛍光色素の組み合わせを慎重に検討する必要があります。このような場合では,スペクトルが重ならない蛍光色素を使用することをお勧めします。

Q-8. HIERを実行するには何が必要ですか?

A-8. Bethyl社では,HIERに広く用いられているスチーマーを使用しています。マイクロ波処理などの他の方法を使用することもできますが,使用前に十分な検証を行って下さい。

Q-9. 1つの組織試料でいくつの標的タンパク質を検出できますか?

A-9. 検出可能な標的タンパク質の数は,利用可能なチラミド蛍光色素とイメージングシステムによって異なります。Vectra Polarisなどのいくつかのスライドスキャナーは,9色スキャン(8種類の免疫染色マーカー+DAPI)を行えます。

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ポスター Multiplex IHC:Making Discoveries Multicolor

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フライヤー

マルチプレックスIHC(mIHC)はがん微小環境を染め分けられます("The Scientist"より転載 The document belongs to "The Scientist".)。

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価格

PathPlex Panelシリーズ

[在庫・価格 :2022年05月18日 23時09分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
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納期 文献数
PathPlex Panel 1 (CD3E, CD8 alpha, PD-L1)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
IHCでの使用が検証済みの抗体3種類のセット。セット内容:抗CD3E抗体(#A700-016), 抗CD8α抗体(#A700-044), 抗PD-L1抗体(#A700-020)。
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 Q9NZQ7
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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PathPlex Panel 2 (CD3E, CD8 alpha, CD20)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
IHCでの使用が検証済みの抗体3種類のセット。セット内容:抗CD3E抗体(#A700-016), 抗CD8α抗体(#A700-044), 抗CD20抗体(#A500-017A)。
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P11836
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 3 (CD3E, CD68, CD20)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
IHCでの使用が検証済みの抗体3種類のセット。セット内容:抗CD3E抗体(#A700-016), 抗CD68抗体抗(#A500-018A), CD20抗体(#A500-017A)。
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P11836 P34810
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 4 (CD3E, Cytokeratin, CD8 alpha, CD68, PD-L1, FOXP3)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P34810 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 Q9NZQ7 Q9BZS1
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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PathPlex Panel 5 (CD3E, Cytokeratin, CD8 alpha, CD68, Ki-67, PD-L1)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P34810 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P46013 Q9NZQ7
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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PathPlex Panel 6 (CD3E, Granzyme B, CD8 alpha, Cytokeratin, Ki-67, SOX10)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P10144 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P46013 P56693
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 7 (CD8 alpha, Cytokeratin, CD45RO, CD4, FOXP3)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 920
Protein Accession No: P01730 P01732 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P08575 Q9BZS1
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
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製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 8 (CD3E, Cytokeratin, CD8 alpha, CD4, LAG3, FOXP3)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01730 P01732 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P18627 Q9BZS1
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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[在庫・価格 :2022年05月18日 23時09分現在]

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PathPlex Panel 1 (CD3E, CD8 alpha, PD-L1)

文献数:0

説明文 IHCでの使用が検証済みの抗体3種類のセット。セット内容:抗CD3E抗体(#A700-016), 抗CD8α抗体(#A700-044), 抗PD-L1抗体(#A700-020)。
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 Q9NZQ7
法規制等
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製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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PathPlex Panel 2 (CD3E, CD8 alpha, CD20)

文献数:0

説明文 IHCでの使用が検証済みの抗体3種類のセット。セット内容:抗CD3E抗体(#A700-016), 抗CD8α抗体(#A700-044), 抗CD20抗体(#A500-017A)。
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P11836
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製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 3 (CD3E, CD68, CD20)

文献数:0

説明文 IHCでの使用が検証済みの抗体3種類のセット。セット内容:抗CD3E抗体(#A700-016), 抗CD68抗体抗(#A500-018A), CD20抗体(#A500-017A)。
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P11836 P34810
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製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 4 (CD3E, Cytokeratin, CD8 alpha, CD68, PD-L1, FOXP3)

文献数:0

説明文 Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P34810 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 Q9NZQ7 Q9BZS1
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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PathPlex Panel 5 (CD3E, Cytokeratin, CD8 alpha, CD68, Ki-67, PD-L1)

文献数:0

説明文 Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P34810 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P46013 Q9NZQ7
法規制等
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製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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PathPlex Panel 6 (CD3E, Granzyme B, CD8 alpha, Cytokeratin, Ki-67, SOX10)

文献数:0

説明文 Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01732 P10144 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P46013 P56693
法規制等
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製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 7 (CD8 alpha, Cytokeratin, CD45RO, CD4, FOXP3)

文献数:0

説明文 Genbank No: 920
Protein Accession No: P01730 P01732 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P08575 Q9BZS1
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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PathPlex Panel 8 (CD3E, Cytokeratin, CD8 alpha, CD4, LAG3, FOXP3)

文献数:0

説明文 Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766 P01730 P01732 P13645 P02533 P19012 P08779 P08727 P18627 Q9BZS1
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2021年9月15日号 p.15

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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[在庫・価格 :2022年05月18日 23時09分現在]

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詳細 商品名
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納期 文献数
Anti-CD3E Recombinant, Rabbit-Mono(BL-298-5D12)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 FCM,IC,IF,IHC,IP,Western Blot
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
掲載カタログ

製品記事 T細胞マーカー抗体
Anti-Rabbibt anti-CD3E Recombinant, Rabbit-Mono(BL-298-5D12) Antibody
Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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Anti-CD4 Recombinant, Rabbit-Mono(BL-155-1C1)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 920
Protein Accession No: P01730
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 FCM,IF,IHC,IP,Western Blot
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
掲載カタログ

製品記事 T細胞マーカー抗体
抗CD4 Recombinant, Rabbit-Mono(BL-155-1C1)抗体 | Anti-CD4 Recombinant, Rabbit-Mono(BL-155-1C1) Antibody
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Anti-CD20, Mouse-Mono(L26)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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Genbank No: 931
Protein Accession No: P11836
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Mouse クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 FCM,IF,IHC,Western Blot
クロナリティ Monoclonal フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
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Anti-CD45RO, Mouse-Mono(UCHL-1)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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Genbank No: 5788
Protein Accession No: P08575
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Mouse クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC,Western Blot
クロナリティ Monoclonal フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
掲載カタログ

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2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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Genbank No: 968
Protein Accession No: P34810
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
抗原種 免疫動物 Mouse クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 FCM,IF,IHC
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
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2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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Genbank No: 925
Protein Accession No: P01732
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
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Anti-Cytokeratin, Mouse-Mono(AE1/AE3)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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Genbank No: 3858
Protein Accession No: P13645 P02533 P19012 P08779 P08727
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Mouse クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC
クロナリティ Monoclonal フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
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Anti-FOXP3, Rabbit-Mono(BLR034F)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 50943
Protein Accession No: Q9BZS1
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC,IP,Western Blot
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
掲載カタログ

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Anti-Granzyme B, Rabbit-Mono(BLR022E)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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Genbank No: 3002
Protein Accession No: P10144
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC,Western Blot
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
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Anti-Ki-67, Rabbit-Mono(BLR021E)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
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Genbank No: 4288
Protein Accession No: P46013
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 FCM,IC,IF,IHC
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
掲載カタログ

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Anti-LAG3, Rabbit-Mono(BLR027F)
2週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
Genbank No: 3902
Protein Accession No: P18627
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit クラス IgG 標識 Unlabeled
交差性 Human 適用 FCM,IC,IF,IHC,IP,Western Blot
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L) 性状 吸収処理
掲載カタログ

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クローン:BLR020E
Genbank No: 29126
Protein Accession No: Q9NZQ7
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit クラス IgG 標識 Unlabeled
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Genbank No: 6663
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法規制等
保存条件 法規備考
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[在庫・価格 :2022年05月18日 23時09分現在]

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Anti-CD3E Recombinant, Rabbit-Mono(BL-298-5D12)

文献数:0

説明文 Genbank No: 916
Protein Accession No: P07766
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吸収処理 クラス IgG
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Anti-CD4 Recombinant, Rabbit-Mono(BL-155-1C1)

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説明文 Genbank No: 920
Protein Accession No: P01730
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Anti-CD20, Mouse-Mono(L26)

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説明文 Genbank No: 931
Protein Accession No: P11836
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交差性 Human 適用 FCM,IF,IHC,Western Blot
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Anti-CD45RO, Mouse-Mono(UCHL-1)

文献数:0

説明文 Genbank No: 5788
Protein Accession No: P08575
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Mouse
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC,Western Blot
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
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Anti-CD68 Recombinant, Mouse-Mono(KP-1)

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説明文 Genbank No: 968
Protein Accession No: P34810
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
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標識 Unlabeled 性状
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CD8 alpha, Rabbit-Mono(BLR044F)

文献数:0

説明文 Genbank No: 925
Protein Accession No: P01732
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
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Anti-Cytokeratin, Mouse-Mono(AE1/AE3)

文献数:0

説明文 Genbank No: 3858
Protein Accession No: P13645 P02533 P19012 P08779 P08727
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Mouse
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
クロナリティ Monoclonal フォーマット Whole(H+L)
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Anti-FOXP3, Rabbit-Mono(BLR034F)

文献数:0

説明文 Genbank No: 50943
Protein Accession No: Q9BZS1
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC,IP,Western Blot
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L)
掲載カタログ

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Anti-Granzyme B, Rabbit-Mono(BLR022E)

文献数:0

説明文 Genbank No: 3002
Protein Accession No: P10144
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC,Western Blot
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L)
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Anti-Ki-67, Rabbit-Mono(BLR021E)

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説明文 Genbank No: 4288
Protein Accession No: P46013
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit
交差性 Human 適用 FCM,IC,IF,IHC
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L)
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Anti-LAG3, Rabbit-Mono(BLR027F)

文献数:0

説明文 Genbank No: 3902
Protein Accession No: P18627
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit
交差性 Human 適用 FCM,IC,IF,IHC,IP,Western Blot
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L)
掲載カタログ

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Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
免疫チェックポイント研究用抗体(Bethyl Laboratories社)
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文献数:0

説明文 クローン:BLR020E
Genbank No: 29126
Protein Accession No: Q9NZQ7
法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit
交差性 Human 適用 IC,IF,IHC,IP,Western Blot
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L)
掲載カタログ

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抗PD-L1, Rabbit-Mono(BLR020E)抗体 | Anti-PD-L1, Rabbit-Mono(BLR020E) Antibody
B7ファミリー関連ウサギモノクローナル組換え抗体(リコンビナント抗体)
Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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Anti-SOX10 Recombinant, Rabbit-Mono(BLR080G)

文献数:0

説明文 Genbank No: 6663
Protein Accession No: P56693
法規制等
保存条件 法規備考
抗原種 免疫動物 Rabbit
交差性 Human/Mouse 適用 IC,IF,IHC,IP,Western Blot
標識 Unlabeled 性状
吸収処理 クラス IgG
クロナリティ Recombinant フォーマット Whole(H+L)
掲載カタログ

製品記事 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody
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(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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