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ノックインマウス作製受託サービス

掲載日情報:2016/11/01 現在Webページ番号:7810

ノックインとは外来遺伝子導入法とも呼ばれる方法です。マウス以外の遺伝子をマウスゲノム上に導入し,タンパク質の機能を解析する方法です。任意の遺伝子座に外来遺伝子を導入,また外来遺伝子のマウスにおける相同遺伝子を破壊するような形で導入する事も可能です。後者は特にノックアウトーノックイン法とも呼ばれています。具体的には膜タンパク質の膜外ドメインだけのヒト化や,標的タンパク質への点変異導入が可能です。マウスタンパク質の局在を調べるためレポータータンパク質(LacZ やGFP)との融合もノックインマウス作製に該当します。株式会社トランスジェニックが行っている遺伝子改変マウス受託において,最も高度な技術を要するマウス作製受託です。

作業概要

No. 工 程 作業内容 標準期間 価格
1 相同組換えベクターの構築 ベクターデザイン

1. 標的遺伝子に関する情報をデータベースより取得
2. デザイン案を作成

2ヶ月~3ヶ月 110万円
ベクター構築

1. High fidelity酵素を用いたPCRで、ES細胞ゲノム断片を増幅
2. PCR産物と薬剤耐性遺伝子との組み合わせによりベクターを構築

2 組換えES細胞株の樹立 ES細胞へのベクター導入と薬剤選択、一次スクリーニング

1. エレクトロポーレーションにより、ベクターDNAをES細胞に導入
2. 薬剤選択により、薬剤耐性ES細胞を取得(標準176クローン)
3. PCRによる導入遺伝子解析、陽性のES細胞株の保存

3ヶ月~4ヶ月 180万円
二次スクリーニングなどによる組換えES細胞株の確定 PCR,サザンブロットによる標的遺伝子構造の解析(最大25クローン)
3 キメラマウスの作製 8細胞期胚とES細胞のアグリゲーションによるキメラマウス作製

最大3株のES細胞クローンをもちいたキメラマウス作製
(全てのキメラマウスがES細胞寄与率80%を下回る場合,再作業)

約3ヶ月 70万円
4 ヘテロマウスの取得 生殖系列キメラマウスの同定 ES細胞寄与率上位3匹のオス・キメラマウスを、メス野生型マウスと交配 約3ヶ月 70万円
ヘテロマウスの取得 ヘテロマウスを同定(微生物検査費用,マウス輸送費用は別途)
5 合計 ※納品にかかる微生物検査費、輸送費は別途必要です。 430万円
6 薬剤耐性遺伝子の除去 薬剤耐性遺伝子の除去 Op. F1ヘテロマウスとCAG-Flpマウス(あるいは,CAG-Creマウス)との交配により,薬剤耐性遺伝子を除去。さらに、野生型マウスと交配させ,Flpトランスジーン(あるいは,Creトランスジーン)を除去 約6ヶ月 65万円

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作業詳細

(1)遺伝子改変ベクターの設計

まずお客様が発現をご希望されるタンパク質のcDNA の調製方法を調査します。お客様が目的タンパク質のcDNA をお持ちでない場合,全長DNA の合成を計画・見積りを行います(費用を別途申し受けます)。また導入遺伝子座周辺領域のクローニングについても提案します。マーカーとなる薬剤耐性遺伝子は将来的にリコンビナーゼで取り除くように設計することも可能です。

(2)遺伝子改変ベクターの設計

より具体的な案を提示して,ベクター構築に取り掛かります。通常,標的遺伝子の周辺領域はPCR にて増幅しクローニングします。cDNA のクローニングも必要なので,他の遺伝子改変マウス作製の場合よりも,時間がかかります。

(3)遺伝子導入から組換えES 細胞を樹立

構築した遺伝子改変用ベクターをエレクトロポレーションを用いてES 細胞に導入します。形質転換したES 細胞のゲノムに,計画通りにベクターが挿入されたかを確認します。形質転換したES 細胞より352 クローンについて確認のための解析を行います。

(4)樹立した組換えES 細胞からマウス作製

樹立した組換えES 細胞よりマウスを作製します。計画通り遺伝子改変用ベクターが挿入されたES 細胞(最大3クローン)からキメラマウスを作製します。形質転換したES 細胞が生殖系列へ移行しているかを確認後,ヘテロマウス作製へと進みます。

(5)納品

お客様のご都合に合わせて,株式会社トランスジェニックからマウスを納品します。通常はヘテロマウス2 ペアを納品しますが,キメラマウス・ホモ遺伝子改変マウスの納品でも対応可能です。納品前に遺伝子型検出のための解析条件を決定します。

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ご注文方法

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