プレデザインされたshRNA発現レンチウイルスプラスミド HuSH shRNA Vector（Lenti Vector）

Q-1. 各プラスミドベクターは何が違うのですか？

A-1. 以下の表をご覧下さい。

※ カスタムHuSH作製サービスでは、上記以外の選択マーカーや蛍光タンパク質を有するベクターも使用できます。ベクターの詳細はこちらをご覧下さい。

Q-2. HuSH製品は遺伝子座特異的であると記載されています。標的遺伝子の変異体やアイソフォームの発現をノックダウンすることをどうやって確認すればよいですか？

A-2. 特に断りのない限り、shRNAコンストラクトはある遺伝子座のほとんどの転写バリアントに対して有効であるように設計されています。特定の転写バリアントに対するノックダウンコンストラクトをご希望の場合、OriGene社では特定のバリアントのみを選択的にノックダウンするカスタムHuSHプロダクトを作成することができます。

Q-3. ある遺伝子に特異的なshRNAコンストラクトのノックダウン効率を評価するために、どのような方法を推奨しますか？

A-3. トランスフェクション後72時間のshRNAコンストラクトのサイレンシング効果を評価するには、qPCRよりもウエスタンブロットを推奨します。ノックダウンを適切に評価するためには、標的特異的shRNAを導入した細胞と、付属のスクランブルコントロールベクターを導入した細胞で、遺伝子発現レベルを比較する必要があります。

Q-4. ヒト、マウス、ラット以外の生物種に対するHuSHコンストラクトを入手することはできますか？

A-4. OriGene社では、あらゆる生物種についてカスタムHuSHの設計・構築を行うことができます。必要な情報は、ターゲットとしたい配列のアクセッションナンバーのみです。

Q-5. 製品はどのように使用すればよいでしょうか？

A-5. 5 μgのshRNA発現プラスミドを直接トランスフェクションして、遺伝子ノックダウン研究に使用することができます。
トランスフェクション後、細胞ライセートを得て、標的タンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロットでshRNAベクターの機能を確認することができます。また、トランスフェクトした細胞からRNAを抽出し、定量RT-PCRで遺伝子発現の消失を決定することができます。
必要であれば、shRNAプラスミドを大腸菌に導入して、増幅することもできます。

Q-6. プラスミドを導入した細胞を選択することはできますか？

A-6. はい、できます。トランスフェクションの1日後から、培地に0.5～1.0 μg/mlのピューロマイシンを添加することで細胞の選択を行えます。

Q-7. 空のベクターはどのような用途に使われるのでしょうか？

A-7. 外来DNAを細胞に導入する実験では、空のベクターをネガティブコントロールとして使用して、非特異的な影響を排除することが重要です。また、このベクターは、お客様が作成したshRNAコンストラクトのクローニングにも使用できます。

Q-8. 遺伝子ノックダウンを示さないスクランブル配列が組み込まれたプラスミドはどのような用途に使われるのでしょうか？

A-8. HuSH製品の発現による非特異的な影響を排除するために、OriGene社では、各種プラスミドに下記のスクランブル配列を組み込んだネガティブコントロールを用意しています（製品ラインナップはA-1.の表をご覧下さい）。これらのプラスミドは、遺伝子特異的なノックダウン実験のネガティブコントロールとして機能し、インターフェロン反応の可能性の排除に使用できます。

組み込んだスクランブル配列：5' GCACTACCAGAGCTAACTCAGATAGTACT 3'

Q-9. HuSHコンストラクトを増幅するためには、特別な菌株の大腸菌を使用する必要があるのでしょうか？

A-9. HuSH増幅に特別な菌株は必要ありませんが、JM109の使用は推奨しません。OriGene社では、New England Biolabs社のDH5αを日常的に使用しています。

Q-10. HuSHプラスミドは高コピー数ですか、低コピー数ですか？

A-10. プラスミドは、高コピー数のOriを有していますが、ヘアピン構造（配列）により複製速度が遅くなるため、低コピー数プラスミドの増幅法を用いることをお勧めします。

Q-11. ピューロマイシンの最適な濃度はどのように決定すると良いですか？

A-11. 最適なピューロマイシン濃度を決定するために、各バッチの細胞についてキルカーブ検討の実施を強くお勧めします。

Q-12. HuSHプラスミドの配列決定には、どのようなプライマーを使用すればよいですか？

A-12. shRNAコンストラクトはヘアピン構造のため、シークエンシングすることが非常に困難です。ご参考までに、シークエンス反応には、終濃度0.83MのBetaineや1×PCRx Enhancer（ThermoFisher Scientific社、#11495017）などのDNA緩和剤を添加することができます。

シークエンシングプライマーは、クローニング部位の3'末端に対応しており、以下の配列を有しています。
5' TTGAGATGCATGCTTTGCATAC 3'

Q-13. レンチウイルスのshRNAベクターはありますか？

A-13. はい、OriGene社では複数のレンチウイルスshRNA製品を取り扱っています。空ベクター（#TR30023）、粒子パッケージングキット（#TR30037）、ネガティブスクランブルレンチウイルスコントロール（#TR30021）です。すべての設計済みのshRNAレンチウイルスキットのカタログ番号はTLXXXXXです。
カスタムshRNA作製サービスのご依頼で、OriGene社のpGFP-C-shLentiベクターを使用するオプションもあります。

Q-14. トランスフェクション法を用いて、レンチベクターのコンストラクト（プラスミド）を目的細胞に導入することは可能ですか？

A-14. はい、アッセイに十分なトランスフェクション効率が得られれば、どのようなトランスフェクション法でも細胞に直接使用することができます。しかし、通常は、組換えレンチウイルス（ウイルスベクター）の感染の方がより効果的です。

Q-15. OriGene社では、遺伝子ノックダウンの検証のための製品を取り扱っていますか？

A-15. はい、OriGene社では、ノックダウン評価に使用できる以下の製品を、多数の因子について取り扱っています。

・qPCRアッセイ（プライマーペアおよびqPCRスタンダード）
・タンパク質検出用のモノクローナル／ポリクローナル抗体

Q-16. レンチウイルスベクターのパッケージングカセットにGFPは含まれていますか？

A-16. はい、GFPはレンチウイルス導入のレポーターとして使用することができます。

Q-17. レンチウイルスベクターで安定細胞株を樹立することはできますか？

A-17. はい、ピューロマイシン耐性マーカーはレンチウイルスパッケージングカセットに含まれています。トランスフェクション時、またはより効果的に組換えレンチウイルス（ウイルスベクター）の感染時に安定した細胞株を選択することができます。

Q-18. shRNA発現プラスミドについて、OriGene社の保証はどのようになっていますか？

A-18. OriGene社は、shRNA発現カセットの配列が標的遺伝子と100％同一であることを保証します。

トランスフェクション効率が80％以上の場合、4つのコンストラクトのうち最低1つは70％以上の遺伝子発現をノックダウンすることが保証されています。トランスフェクション後72時間のshRNAコンストラクトのサイレンシング効果を評価するには、qPCRよりもウエスタンブロットデータを推奨します。ノックダウンを適切に評価するためには、標的特異的なshRNAをトランスフェクションした試料と比較して、含まれるスクランブルコントロールベクターの遺伝子発現レベルを使用する必要があります。

不適合なshRNAについては、shRNAキットの納品日から90日以内に交換品の依頼をしていただく必要があります。新しく設計されたコンストラクトとの無料交換をご希望の場合は、フナコシ（株）テクニカルサポートまでご連絡下さい。その際に、トランスフェクションの効率と、スクランブルshRNAコントロールと比較した遺伝子発現のノックダウンの測定データを提供して下さい（ウエスタンブロットデータを推奨します）。