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AAV産生時に感染力および品質を向上させるヘルパープラスミドとRepCapプラスミド pPLUS AAV Packaging

掲載日情報:2024/07/10 現在Webページ番号:70746

rAAV(Recombinantadeno-associated virus、組換えアデノ随伴ウイルス)産生において、お手持ちのTransgene PlasmidpPLUS AAV-Helper(ヘルパープラスミド)とpPLUS AAV-RC Range(Rep/Capプラスミド)を組み合わせたトリプルトランスフェクション法に最適化されたpPLUS AAV Packagingを用いることにより、高品質で感染性の高いrAAVを高収量で得ることができます。

pPLUS AAV-Helper

トリプルトランスフェクション法とは

カチオンポリマーを用いたpDNAのトリプルトランスフェクション

カチオンポリマーを用いたpDNAのトリプルトランスフェクション

rAAVを産生するための最も確立された方法は、3つのプラスミドの同時トランスフェクションが必要です。1つは目的遺伝子(GOI、Gene of interest)をコードするトランスジーン、もう1つはパッケージングプラスミドです。

トリプルトランスフェクションプロセスにおいてrAAV産生に用いられるプラスミド

トリプルトランスフェクションプロセスにおいてrAAV産生に用いられるプラスミド

  • トランスジーン:治療効果のための目的遺伝子を含み、宿主細胞において発現を可能にするために2つのITR(Inverted Terminal Repeat)が挟まれている。
  • pHelper:ウイルス複製に必要な「ヘルパー」機能をコードする。
  • pRep/Cap:ウイルス複製に必要なタンパク質(Repタンパク質)、カプシド構造(VP1、VP2、VP3)、およびアクセサリタンパク質(AAP、MAAP)をコードする。

AAVウイルスベクターは、非病原性ウイルス由来で自己増殖能がなく、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染でAAVウイルス粒子を産生します。そのため、Rep/Capプラスミドと共にヘルパープラスミド(rAAVの複製とカプシド形成を支援するための遺伝子を含む)がトランスフェクトされます。GOIをウイルス粒子にパッケージングするためには、これらの2つのプラスミドが必要となります。ヘルパープラスミドには、通常、rAAV複製に必要なアデノウイルス遺伝子(E1A/B、E2A、E4、およびVA RNA)が含まれています。ただし、単純ヘルペスウイルス(HSV)やヒトボカウイルス(HboV)など、他のウイルスもヘルパーウイルスであることが知られています。



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pPLUS AAV-Helper

pPLUS AAV-Helperは、FectoVIR-AAVによって得られたウイルス粒子の感染力(TU/mlで測定)と品質(full/empty比)の改善を目的として、Polyplus-transfection社(以下Polyplus社)独自のDNAアセンブリ技術(e-Zyvec技術)に基づいた広範な研究開発プログラムにより、複数の遺伝的特徴の相乗効果の探索を行い開発されました。

動画 pPLUS AAV-Helper is a novel plasmid helper designed for AAV production

本動画は、同社のグローバルプロダクトマネージャーであるLaure Robert氏により、このヘルパープラスミドについて解説したものです。

e-Zyvec技術とは

従来のクローニングの多くは、マルチクローニングサイト(Multi-Cloning Site、MCS)を含むあらかじめ決められたプラスミドの骨格に依存しています。この方法は多くの研究室で用いられていますが、一方でMCS以外の領域での改変は難しいため、配列や構造の最適化に制限があります。より多くの核酸ベースの治療法が開発され、臨床段階に移行する中、治療の有効性と効率性を考える上で、プラスミドのサイズだけでなく、プラスミド全体の正確な設計の重要性が、良く認識されるようになりました。

Polyplus社のe-Zyvec技術は、独自のプラスミドの構築方法により、複雑なコンストラクトを簡単に入手することが可能となります。具体的には、プラスミド全体をいくつかの線状DNAフラグメントとして設計し、ワンステップの酵素反応でそれらを完全長のコンストラクトとして構築します。この操作で用いる個々の線状DNAフラグメントは、最大限のアセンブリ成功率を可能にするPolyplus社社内開発のソフトウェアを使用して、プラスミドエンジニアリングのスペシャリストによって注意深く設計されます。 これにより、既存のバックボーンに限定されずにオーダーメイドのプラスミドを作成したり、元のプラスミドの任意の領域をタイムリーな最適化を行うことが期待できます。

従来のクローニング法

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従来のクローニング法

e-Zyvec技術によるコンストラクト構築

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e-Zyvec技術によるコンストラクト構築


pPLUS AAV-Helperベクター情報

pPLUS AAV-Helperベクターマップ

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pPLUS AAV-Helperベクターマップ

pPLUS AAV-Helperは、AAV粒子の感染力を向上させる新しいヘルパーエレメントを組み込んだヘルパープラスミドです。プラスミドのサイズ(13.3 kb)は、標準的なヘルパープラスミドと比べて小さく、その配列にはHexon Associated PrecursorおよびFiber配列は含まれていません。

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特長

  • ウイルス粒子の感染力(TU/ml)および品質(full/empty比)が向上します。
  • FectoVIR-AAVとの併用に最適化されています。
  • PEIproおよびその他のトランスフェクション試薬とも併用できます。
  • さまざまな細胞株における、さまざまな血清型(セロタイプ)のAAVの産生に適しています。
  • カナマイシン耐性遺伝子を有しています。
  • 商用などに際し、ライセンスおよびロイヤリティーの必要はありません。

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使用例

FectoVIR-AAVの併用によるAAVの産生量と感染力の向上

F17培地中で懸濁培養したHEK293T細胞において、PEIproFectoVIR-AAVまたはB社トランスフェクション試薬と、A社pHelperまたはpPLUS AAV-Helperを組み合わせてそれぞれAAV9を産生した。

pPLUS AAV-Helperを使用した場合、いずれのトランスフェクション試薬を用いてもA社pHelperに比べて力価(VG/ml)および感染力(TU/ml)の向上が見られた。また、pPLUS AAV-HelperとFectoVIR-AAVを併用した場合では、A社pHelperとB社トランスフェクション試薬の組合せと比べて、相乗効果により力価(VG)が最大4倍、感染力(TU)が8倍向上することが示された。

pPLUS AAV-HelperとFectoVIR-AAVの併用によるAAVの産生量と感染力の向上

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pPLUS AAV-HelperとFectoVIR-AAVの併用によるAAVの産生量と感染力の向上


さまざまな血清型(セロタイプ)における力価(VG/ml)と感染力(TU/ml)の向上

F17培地中で懸濁培養したHEK293T細胞において、FectoVIR-AAVと、pPLUS AAV-HelperまたはA社pHelperを組み合わせてAAV2、AAV5、AAV8およびAAV9を産生した。産生したAAVを用いてHT-1080細胞に対してトランスダクションアッセイを実施し、力価の向上をA社pHelperに対する増加倍数としてそれぞれ示した。

力価と感染力の向上はさまざまな血清型で観察された。

さまざまな血清型(セロタイプ)における力価(VG/ml)と感染力(TU/ml)の向上

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さまざまな血清型(セロタイプ)における力価(VG/ml)と感染力(TU/ml)の向上


HEK293由来のさまざまな細胞株におけるAAV2の力価の向上

表中に示した各種HEK293由来細胞株をそれぞれ表中に示した培地で増殖し、FectoVIR-AAVと、pPLUS AAV-HelperまたはA社pHelperを組み合わせてAAV2を産生した。力価の向上は、A社pHelperに対する増加倍数としてそれぞれ示した。

pPLUS AAV-Helperは、AAV産生工程で一般的に使用されるさまざまな細胞株に使用した場合において、一貫した性能を示した。

HEK293由来のさまざまな細胞株におけるAAV2の力価の向上

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HEK293由来のさまざまな細胞株におけるAAV2の力価の向上

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pPLUS AAV-RC Range

pPLUS AAV-RC Rangeベクター情報

pPLUS AAV-RC Rangeベクターマップ

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特長

  • 効率的かつ高いAAV生産性と高い感染力価で、pPLUS AAV-Helperとの併用に最適化されています。
  • さまざまなスケールのニーズに応じて、3種類の包装(1、10、100 mg)をご利用いただけます。
pPLUS AAV-RC Range

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使用例

pPLUS AAV Packagingと他社とのウイルス力価比較

ウイルス力価比較

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ウイルス力価比較

pPLUS AAV-RCは、AAV産生用に設計されたRepCapプラスミドで、pPLUS AAV-HelperおよびFectoVIR-AAVと組み合わせて使用することにより強力なパフォーマンスを発揮する。これらを用いてpPLUS AAV Packagingを使用した場合、A社と比較してウイルス力価が1.7~2.9倍増加した。


pPLUS AAV Packagingと他社とのAAVの感染力比較

感染力の比較

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感染力の比較

pPLUS AAV Packgingを使用すると、A社と比較して感染力が3.5 ~ 3.9倍増加した。


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