ユーザーレビュー【広告】 化学合成ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを用いたSMARCA1遺伝子ノックアウト細胞の樹立

星薬科大学　先端生命科学研究所
エピゲノム創薬研究室　特任准教授　竹島 秀幸 先生

　DNAメチル化異常（エピゲノム異常）は、突然変異と同様にがん抑制遺伝子を不活化することで発がんに深く関与しています。このDNAメチル化異常の大きな特徴の1つは、がんが発生するはるか以前のポリクローナルな正常組織においても非常に高レベルで蓄積していることです。正常組織におけるDNAメチル化異常の蓄積レベルは、がんが発生するリスクと相関することが知られています。このことから、正常組織において様々ながん抑制遺伝子のメチル化が蓄積することで、がんが発生しやすい状態（エピジェネティックな発がんの素地）が形成されていると考えられます（図1）。我々はこれまでに、このエピジェネティックな発がんの素地を形成する可能性のある遺伝子を多数同定してきました^{1, 2}。
　本稿では、我々がこれまでに見出している胃がんにおけるメチル化不活化遺伝子の1つであるSMARCA1を例に、その機能解明のためのノックアウト細胞作製について、Cas9タンパク質とデザイン済みの化学合成ガイドRNAを用いた際の高いノックアウト効率についてお示しします。

図1：DNAメチル化異常による発がんの素地形成

　化学合成ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼを導入した場合には、取得した60個のシングルセルクローンのうち6個（10％）で両アレルにおけるKOが認められました（図2）。ウェスタンブロット法によりタンパク質レベルでの発現を確認したところ、これらのKOクローンではSMARCA1タンパク質の完全な消失が認められました。一方、他社Cas9 mRNA製品を用いた場合は、両アレルKOクローンの取得率は～2％程度でした。

図2：両アレルKOクローンの取得率