細胞ベースELISAキットでリン酸化リボソームタンパク質（S235/236）を測定するキット EnzyFluo Human/Mouse RPS6（S235/236） Phosphorylation ELISA Kit

• 使用例
• リボソームタンパク質S6（Ribosomal Protein S6、RPS6）とは
• 測定原理
• 特長
• 操作方法概略
• キット内容
• 関連製品 EnzyFluo Phosphorylation ELISA Kitシリーズ
• 価格

使用例

BioAssay Systems社では、2018年1月1日より緑化推進のために製品へのプロトコルの添付を廃止しました。各製品のプロトコルについては、BioAssay Systems社ホームページよりダウンロードしてご利用下さい。

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リボソームタンパク質S6（Ribosomal Protein S6、RPS6）とは

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測定原理

• A. 96ウェルプレート中で細胞を培養する。
• B. 一次抗体（Ab1、マウス抗リン酸化RPS6（S235/236）抗体）を添加する。
• C. 二次抗体（Ab2、gM-HRP、HRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体）を添加する。
• D. 蛍光基質を添加し、蛍光強度を測定する。

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特長

• 操作は簡便で、細胞の溶解は必要ありません。
• アッセイの改良により、測定時間は従来の9時間から5時間へと短縮されています。
• 細胞は96 wellプレート内で直接培養することができます。
• 同じウェル中で標的のリン酸化タンパク質と、総タンパク質を異なる測定波長で測定することで、相対値が得られます。
• フォーマット：96 well plate
• 測定動物種：ヒト、マウス、ラット
• 測定試料：培養細胞
• 測定原理：細胞ベースELISA
• 測定方法：蛍光
• 測定波長：リン酸化標的タンパク質：励起 530 nm／蛍光 585 nm、総タンパク質：励起 360 nm／蛍光 450 nm
• アッセイ数：100 tests

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操作方法概略

アッセイ前の留意事項

1. クロスコンタミネーション防止のため、マルチチャンネルピペットを使用し、ピペットチップは各試薬、試料ごとに交換する。アッセイ開始前に、製品データシートを参照し、Wash buffer（1×）を調製する。
2. 二重または三重試験以上で実施する。
3. Protein Blank（細胞なし）とSample Blank（Ab1を添加せずに、Ab2のみを添加）の2種類のブランク（各3点）が必要となる。これらのブランクは、それぞれ総タンパク質とpRPS6（S235/236）のバックグラウンド蛍光強度の決定に使用する。

A. 細胞の培養と処理

1. 1～3×10⁴個の接着細胞（または4～10×10⁴個の浮遊細胞）100μlを黒色96ウェル培養プレートの各ウェルに播種する。細胞フリーの培養培地100μlをProtein Blankの3つのウェルに加える。細胞培養用インキュベーター中で37℃で一晩インキュベートする。
   ※ 最適細胞数は細胞株と標的タンパク質のリン酸化レベルに依存するため、必要に応じて調整する。
2. 目的に応じて細胞を処理する（例、リガンドまたは薬物）。
3. ホルムアルデヒド溶液を調製する。接着細胞には4％（wt）ホルムアルデヒド溶液を調製し、各ウェルの培地と4％ホルムアルデヒド溶液100μlをと交換することにより細胞を固定する。
   浮遊細胞には8％（wt）のホルムアルデヒドを調製し、培養プレートを遠心後にペレットに影響のないように上清をできるだけ除去し、8％ホルムアルデヒド100μlを添加して細胞を固定する。
   プレートにフタをして、室温で20分間インキュベートする。固定細胞の入ったプレートは、シールをして2～8℃で最大2週間保管できる。
4. ホルムアルデヒドを除去する。Wash buffer（1×）200μlを加え、穏やかに撹拌しながら3分×2回洗浄する。
5. 製品データシートを参照してQuench bufferを調製する。Wash bufferを除去後にQuench buffer 100μlを各ウェルに加える。プレートにフタをして室温で20分間インキュベートする。
6. Quench bufferを除去後に、Wash buffer 200μlを加え、穏やかに撹拌しながら細胞を3分×3回洗浄する。
7. Wash bufferを除去後、Blocking buffer 100μlを加える。プレートにフタをして室温で1時間インキュべートする。

B. 一次抗体（Ab1）の添加

1. 製品データシートを参照し、Ab1とBlocking bufferを混合してAb1 mixture 55μl/wellを調製する。
2. すべてのアッセイウェルのBlocking bufferを除去する。Sample BlankにはBlocking buffer 50μlを添加し、試料のウェルにはAb1 mixture 50μlを添加する。プレートにフタをして室温で90分間、または2～8℃で一晩、穏やかに撹拌しながらインキュベートする。
3. Ab1 mixtureを除去し、Wash buffer 200μlで穏やかに撹拌しながら3分×3回洗浄する。

C. 二次抗体（Ab2）の添加

1. 製品データシートを参照し、Ab2とBlocking bufferを混合してAb2 mixture 55μl/wellを調製する。
2. Wash bufferを除去後、Ab2 mixture 50μlをすべてのウェルに添加する。プレートにフタをして室温で90分間、穏やかに撹拌しながらインキュベートする。

D. 検出

1. 各ウェルからAb2 mixtureを除去後、細胞をWash buffer 200μlを用いて穏やかに撹拌しながら3分×4回洗浄する。
2. 製品データシートを参照し、使用直前に6μlの3％ H₂O₂をHRP substrate 6 mlに加える（一部のプレートでアッセイを行う場合には、適時容量を調整する）。Wash bufferをプレートから除去後に、マルチチャンネルピペットを使用して迅速に各ウェルに調製した混合HRP substrate 50μlを添加する。室温、暗所において30分間インキュベートする。
3. マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルにProtein stain 50μlを迅速に添加し、室温、暗所でさらに5分間インキュベートする。
4. pRPS6（S235/236）（λ_ex/em=530/585 nm）、および総タンパク質（λ_ex/em=360/450 nm）の蛍光強度を測定する。

計算