ご希望の配列のオリゴヌクレオチドをご自身で迅速・簡単に抗体へ標識 oYo-Link Oligo Custom

実際の操作時間はわずか30秒＊1で、抗体のFc領域（最大2ケ所）にオリゴヌクレオチドを部位特異的に標識できる試薬です。ご希望の配列のオリゴヌクレオチド（一本鎖または二本鎖DNA）を合成し、oYo-Link Oligo試薬をカスタム作製いたします。oYo-Link Oligo試薬を用いて標識した作製したDNA結合抗体は、CITE-seq、Immuno-PCRおよび近接ライゲーションアッセイなどのアプリケーションに使用できます。

＊1 試料と混合（約30秒）し、UV照射（2時間）することで抗体を標識できます。
※ AlphaThera社oYo-Linkシリーズのラインナップは、oYo-Link 抗体ラベリング試薬をご覧下さい。
※ 高感度アッセイを行われるお客様向けの未反応のoYo-Linkを除去する試薬は、oYo-Capture Magnetic Beadsをご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

※ oYo-Linkによる抗体標識には、専用のUVリンカー（#AT8001-D）が必要です。詳細はこちらをご覧下さい。

CITE-seq（Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing）は、ニューヨークゲノムセンター（NYGC）が開発した単一細胞生物学の研究のための革新的な技術で、個々の細胞の分析、異なる細胞型の区別、細胞レベルでの病気のメカニズムの研究を可能にします。CITE-seqは、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いて、特定の細胞表面タンパク質を測定すると同時に、そのタンパク質を発現している1個の細胞のmRNAをシークエンシングし、プロテオームとトランスクリプトームを同時に見ることができます。CITE-seqを行う上で、最も重要な要素の1つは、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの設計です。抗体に結合しているDNAタグの数にばらつきがないこと、抗体の抗原認識部位をマスクしないことが必須ですが、市販の抗体-オリゴヌクレオチド標識試薬の多くは、第一級アミンを標的とした技術を利用しているため、これらの実現が困難な場合があります。

CITE-seqの模式図
A）細胞表面タンパク質に特異的な抗体を細胞へ結合させる。この抗体には、特定の細胞表面タンパク質を識別するためのオリゴタグ（バーコード配列）が結合している。
B）それぞれの液滴中に、抗体が結合した細胞1個とマイクロビーズを封入する。
C）液滴内で細胞を溶解する。細胞からmRNAが抽出され、同時に抗体からオリゴタグ（バーコード配列）が遊離する。
D）mRNAおよびオリゴタグをマイクロビーズに結合させ、ライブラリーを調製した後、NGS解析を行う。バーコード配列により、あるタンパク質が発現している細胞におけるmRNA発現量を定量できる。

Immuno-PCRは、ELISA法の特異性とPCR法のシグナル増幅を組み合わせた免疫検出法です。抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いることで、Immuno-PCRは従来のELISAに比べ100～1,000倍の感度を持ち、必要な抗体量も非常に低量です。ELISAは標識抗体を用いて、標的タンパク質を検出するため、高い特異性が得られますが、非常に低濃度のタンパク質を検出するには十分な感度が得られない場合があります。RT-PCRは抗体を使用しないため、抗原の検出に直接使用できませんが、指数関数的にシグナルが増幅されます。Immuno-PCRは、抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートを用いて、この2つのアッセイフォーマットを組み合わせることで、両方の長所を生かすことができます。また、検出抗体を抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲートに置き換えることで、あらゆるタイプのELISAをImmuno-PCRに変換できます。このようにImmuno-PCRは利点を有するにも関わらず、現在もELISAが免疫検出の主要な方法であることに変わりはありません。これは、抗体へのオリゴヌクレオチドの結合が、特別な専門知識を必要とし、高価で時間のかかるプロセスであると考えられてきたことも理由の一つです。

Immuno-PCRのステップ
A）標的抗原に特異的な捕捉抗体をマイクロタイタープレートのウェル底面に固相化する。
B）プレートをブロッキング後、試料を添加する。未結合の試料を洗浄で除去する。
C）抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート（検出抗体）を加える。
D）リアルタイムPCRによりDNAを増幅して検出する。

近接ライゲーションアッセイ（Promixity Ligation Assay、PLA）は、高感度で特異性の高いタンパク質解析用の免疫組織化学的ツールです。Immuno-PCRと同様にELISA法の特異性とPCR法の感度を併せ持ちます。典型的な近接ライゲーションアッセイでは、2種類の標的を検出するためにそれぞれ異なる動物種に免疫した2種類の一次抗体と、一次抗体に結合する2種類の抗体-オリゴヌクレオチドコンジュゲート（PLAプローブ）を使用します。標的タンパク質が隣接している場合、2つのPLAプローブが近接し、PLAプローブの自由端はDNAリガーゼによりライゲーションされます。これにより、ローリングサークル増幅（RCA）が起こり、環状DNAが1,000倍に増幅され、リアルタイムPCR装置で定量することができます。近接ライゲーションアッセイは、迅速かつ容易に実施でき、高感度かつ特異性が高いこと、信頼性の高い結果が得られること、またマルチプレキシングが可能であるといった利点があります。しかし、非特異的なライゲーションによる高いバックグラウンドや、PLAプローブ作製のための時間、コスト、専門知識が必要であるなど、課題もあります。

近接ライゲーションアッセイ（間接法）の模式図
A）標的タンパク質が隣接している場合、2つのPLAプローブが近接する。
B）PLAプローブの自由端はDNAリガーゼによりライゲーションされる。
C）ローリングサークル増幅（RCA）により環状DNAが1,000倍に増幅され、リアルタイムPCR装置で定量が可能となる。

oYo-Link Oligo 1 μlを抗体（ヒトIgG1）1 μgと混合し、365 nmのUV下で2時間光架橋し、電気泳動を行った。架橋後の試料では、抗体重鎖の上方へのシフトが確認できる（Lane3）。また、oYo-Link Oligoの抗体への標識効率が90%以上であることが示された。

配列や長さが異なるoYo-Link Oligo各1 μlと抗体（ヒトIgG1）1 μgをそれぞれ混合し、365 nm UV下で2時間光架橋し、電気泳動を行った。配列や長さが異なるカスタムオリゴを使用した場合も架橋後の試料では、それぞれ抗体重鎖の上方へのシフトが確認できる（Lane4）。また、それぞれのoYo-Link Oligoの抗体への標識効率が90%以上であることが示され、配列や長さが異なるオリゴヌクレオチド間において、標識効率に大きな差は見られなかった。

細胞結合アッセイには、Her2を過剰発現させたSK-BR-3細胞と、oYo-Link Oligoで標識したヒト抗Her2抗体およびヒト抗CD20抗体を使用した。SK-BR-3細胞を、oYo-Link Oligo標識／未標識のヒト抗Her2抗体、およびoYo-Link Oligo標識ヒト抗CD20抗体（ネガティブコントロール）でそれぞれインキュベートした。各抗体とインキュベートしたSK-BR-3細胞を洗浄後、Alexa647標識ヤギ抗ヒト二次抗体とFITC標識オリゴプローブで染色し、FACS解析を行った。Alexa647（FL4）のシグナルのポジティブシフトは、Her2+SK-BR-3細胞への抗Her2抗体の結合を示し、FITC（FL1）シグナルのポジティブシフトは、抗体結合によるオリゴヌクレオチドの存在を示す。oYo-Link Oligo標識ヒト抗Her2抗体が結合したSK-BR-3細胞は、強いAlexa647（FL4）ポジティブシフトとFITC（FL1）ポジティブシフトを示した（緑色）。ネガティブコントロール（青色）では、Alexa647（FL4）シグナルシフトは観察できなかった。oYo-Link Oligoを標識していない抗Her2抗体が結合したSK-BR-3細胞（赤色）およびネガティブコントロール（青色）では、FITC（FL1）シグナルシフトは観察されなかった。この結果は、oYo-Link Oligo標識抗体は、細胞ターゲットに特異的に結合していることを示唆する。

UV（365 nm）を用いて架橋したoYo-Link OligoのPCR増幅への影響
セツキシマブ（Cetuximab）へのUV（365nm）架橋前後のoYo-Link OligoをReal-time PCR増幅の鋳型として使用した。16.5 μMのoYo-Link Oligoから始め、UV架橋前後の鋳型を1:1,000～1:10,000,000倍に希釈した。増幅産物の検出にはSYBR Greenを使用し、ベースラインでの減算で正規化したシグナルをY軸にプロットした（Delta Rn）。Real-time qPCRアッセイには、鋳型なしのコントロールも含まれている。UV架橋前後のoYo-Link Oligoのサイクル閾値（Ct）値に有意な差は認められない。365 nmのUVによる架橋は、oYo-Link OligoのPCR増幅に影響を与えない。

oYo-Linkによる抗体標識には、専用のUVリンカー（#AT8001-D）が必要です。
以下のアイコンをクリックすると価格をご確認いただけます。

※UVリンカーの仕様についてはLED Photo-Crosslinking Deviceをご確認下さい。また、使用方法についてはユーザーマニュアルをご確認下さい。
※UV照射時は氷を使用します。

UVリンカーの貸出デモを実施中です。
デモをご希望の方は申込用紙に必要事項をご記入の上、ご利用の販売店担当者にお渡し下さい。
AlphaThera社 UVリンカー貸出申込用紙

10～80 bpの長さのご希望の配列のオリゴヌクレオチド（一本鎖DNA（商品コード末尾：-ss）もしくは二本鎖DNA（商品コード末尾：-ds））のoYo-Link Oligo試薬をカスタム作製いたします。
専用注文書にご希望の配列を記載の上、ご注文下さい。
※ ＞80 bpのオリゴヌクレオチドをご希望の場合は、お問合せ下さい。