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三次元培養,オルガノイド・スフェロイド作製用チップ 3D CoSeedis

掲載日情報:2020/10/22 現在Webページ番号:69585

3D CoSeedisは多孔質アガロースを材質とした足場を必要としない三次元培養器材です。 6ウェルまたは24 ウェルのプレートに,対応する3D CoSeedis Chipを入れて使用します。
細胞を播種すると,くぼみに細胞が集まり凝集体(スフェロイド・オルガノイド)ができます。
作製したスフェロイド・オルガノイドは培地,酸素,成長因子などが全方位から供給され,10週間以上の長期培養も可能です。

細胞を混合して共培養する「Contact Co-culture」に加え,距離を置いて共培養する「Distance Co-culture」も可能です。

3D CoSeedis-A 3D CoSeedis-B 3D CoSeedis-C 3D CoSeedis-D 3D CoSeedis-E 3D CoSeedis-F 3D CoSeedis-G 3D CoSeedis-H

abc biopply-3D CoSeedis

コロニー形成アッセイ(CFA, Colony Forming Assay)とは

CFAとその問題点

CFA, は,in vitroでの細胞生存に関する機能試験方法です。CFAでは,コロニーは少なくとも50個の細胞で構成されると定義され,その単一細胞はコロニーに成長する能力に基づいています。このアッセイは,悪性細胞の自己再生に対する化学的,または放射線治療の効果の決定に特に有用で,がん研究に広く用いられています1,2。しかし,CFAの現在のプロトコルは複雑で手間を要し,特にアッセイの分析においては,結果を解釈する人によってはかなりの不一致を引き起こす傾向があります。これは,軟寒天または2Dプロトコルを用いた異なる焦点レベル,および座標でのコロニーのランダムな分布が原因となっています。

参考文献

  1. Hoffman, Robert, M., Journal of Clinical Laboratory Analysis, 5(2), 133~143 (1991).
  2. Von, Hoff, DD., "He’s not going to talk about in vitro predictive assays again, is he?" JNCl, 82, 96~101 (1990).

3D CoSeedisとは

3D CoSeedisは,ポリオキシメチレン(POM)ブロックで作製したポリジメチルシロキサン(PDMS)の鋳型に加熱されたアガロースを充填することにより製造された円錐状のアガロース製マイクロウェルアレイ(CAMA,Conical Agarose Microwell Array)です。

3D CoSeedisの製造工程


3D CoSeedisの製造工程

3D CoSeedisの製造工程

参考文献

  • Andreas, R. Thomsen, et al., "A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement.", Lab Chip, 18, 179, DOI: 10.1039/c7lc00832e (2018).

3D CoSeedisの効果

3D CoSeedisは,接着非依存細胞用のためのCFAの新しい方法を提供します。この方法は,コロニーを適所かつ局所に固定し,(半)自動のバイナリアッセイを可能にします。

3D CoSeedis



3D CoSeedis 3D CoSeedis 3D CoSeedis 3D CoSeedis

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特長

  • 高い再現性が得られます。
  • 非常に均一で均質なオルガノイドを容易に大量生産することができます。
  • アレイ内の円錐形のマイクロウェルにより,凝集体の体積(細胞増殖)を正確に測定できます。
  • 幅広い疾患モデルに適応します。
  • ハイスループットスクリーニング(HTS),ハイコンテントスクリーニング(HCS)に適応しています。
  • 培養後パラフィン包埋して染色することもできます。

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製品の種類

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品名 3D CoSeedis
Chip200 Chip880 Chip680
製品外観 Chip200製品外観 Chip880製品外観 Chip680製品外観
製品仕様 Chip200 Chip880 Chip680
適合プレート 6-wells 24-wells
1チップ当たりのオルガノイド生成可能数 200 880 680
チップ数 1 6 1 6 1 6 12
商品コード C200 C200-6 C880 C880-6 C680 C680-6 C680-12

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使用例

少分割照射後と温熱療法(HT)併用有無における微小腫瘍のサイズの追跡

チップが多孔性アガロースでできており,作製したオルガノイド・スフェロイドには培地,酸素,成長因子などを全方位から供給できる。長期間(最大10週間)培養できた例もある。
Andreas, R. Thomsen, et al., Lab. Chip, 18, 179~189 (2018).

少分割照射後と温熱療法(HT)併用有無における微小腫瘍のサイズの追跡

凝集細胞容積の経日変化

スフェロイド・オルガノイドの粒径分布

スフェロイド・オルガノイドの粒径分布

回収したWiDrスフェロイド

スフェロイド・オルガノイドの粒径分布

スフェロイドの粒径分布(98.2%の均質性)

ハンギングドロップ(HD)および液体オーバーレイ法(LO)との比較

単一の細胞凝集体の画像。FDA-(緑/生細胞)およびPI-(赤/死細胞)で染色された凝集体の蛍光顕微鏡像。3D CoSeedisは,典型的なネクローシスコアを示す正しい三次元構造を模倣することがわかる。ヒト膵臓がん細胞株MiaPaCaのように,従来のハンギングドロップや液体オーバーレイ法では十分な凝集体が得られなかった細胞であっても,3D CoSeedisによって三次元培養を行うことができる。

三次元培養における細胞の凝集

三次元共培養

3D CoSeedisは,三次元共培養(3D co-culture)において,接触培養(Contact culture)および遠隔培養(Distance culture)の両方に適用できます。接触培養においては,細胞を混合して播種し(下図左),遠隔培養においては,例えばフィーダー細胞をモノレイヤーで培養し,その上部でアレイで細胞凝集体を培養します(下図右)。

三次元共培養

3D CoSeedisを用いた三次元共培養

遠隔共培養では,マイクロウェルとプレート底面で異なる細胞を分けて培養(フィーダー細胞と接触させずに共培養)し,接触培養と同等の結果を得ることができる。また,それぞれの細胞を簡単に分離・回収できる。


接触共培養

遠隔共培養

接触および遠隔共培養におけるT47D乳がん細胞の増殖およびスフェロイド形成に対するヒトMSCの効果を検証した。ボリュームの決定はd20で行った(n=3)。上図左に4つのスフェロイドのスキャン,下図右に3D CoSeedisのスキャン(上図右)の結果を示した。データは平均値±SEMを示す。 *:P <0.05, **:P <0.01,***:P <0.001。

  • T47D細胞の播種:10 cells/well(cpm)
  • 接触共培養用MSC:10 cpm
  • 遠隔共培養用MSC:103 cells/cm2

三次元細胞培養の免疫組織染色例

三次元細胞培養の免疫組織染色例

  • A:スライドの準備
    ホルマリン固定したマイクロウェルアレイを低融点(LMP)アガロースでシーリングする。脱水,パラフィンに浸した後にアレイを反転し,パラフィン包埋してからカセットにマウントする。2μm切片を,後の標準的な染色操作のために準備する。
  • B:乳がん関連線維芽細胞(BrCa-aF),乳がん細胞(BT-474およびMDA-MB-231),膵臓がん細胞(MIAPaCa-2)の免疫染色像

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適用例

本製品は,以下の細胞,培養において適用を確認済みです。

種別 部位 細胞名
腫瘍/がん1,2 乳房 B16, BT-474, BT-549, MCF7, MDA-MB-231, T47D, rat MTPa3
A-549
結腸 HT-29, WiDr
類表皮がん A431
膠芽腫 GBM4, U251
下咽頭がん FaDu
肝臓がん Hep3B, HepG2, Huh-7
リンパ腫 U937
多発性骨髄腫 L363, U266
膵臓がん MIAPaCa-2, Panc -1, PSN-1
前立腺がん LNCap, PC-3, 22Rv14
食道腺がん OE-193
肝細胞がん Snu
Tリンパ球がん HuT-78*1
Bリンパ球がん Raji*1
間葉系幹細胞1,2 脂肪組織由来 Adipo-MSC
骨髄由来1,2 BM-MSC
線維芽細胞1,2 乳がん関連線維芽細胞 BrCa-aF
造血幹細胞1,2 臍帯血由来 CD34+ HSC
上皮細胞1,2 BEAS-2B, NBEC, FBEC
骨形成分化1~3 BM-MSC由来
軟骨形成分化1,2 BM-MSC由来

参考文献

  1. Andreas R. Thomsen, et al., "A deep conical agarose microwell array for adhesion independent three-dimensional cell culture and dynamic volume measurement.", Lab. Chip, DOI 10.1039/C7LC00832E.
  2. Andreas R. Thomsen, et al., "Modelling gastrointestinal cancer cell interaction with tumor stroma in a 3D microwell array.", poster presented at GBS, (2017).
  3. Personal communication: Dr. A. R. Thomsen, Universitätsklinikum Freiburg, Germany.
  4. Personal communication: Dr. C. Zamboglou, Univeristätsklinikum Freiburg, Germany.

*1 abc biopply社内での観察:マイクロウェルに沈殿した古典的な凝集のない浮遊細胞


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3D CoSeedisの新しい応用例

COVID-19関連サイトカイン放出症候群における新規in vitro研究へのアプローチ

COVID-19患者に致命的な病気の進行を引き起こす主要な要因の1つに,サイトカイン放出症候群(CRS, Cytokine Release Syndrome)があります。3D CoSeedisによるin vitro三次元細胞培養技術は,生理学的により適切な条件下においてCRSを研究する新しいアプローチとなることが期待できます。

COVID-19関連サイトカイン放出症候群における新規in vitro研究

急性炎症またはウイルス感染時の様々な細胞集団の相互作用を試験するためのセットアップ

「上皮細胞」候補は,肺がんまたは正常気道上皮に由来する細胞株より,「間葉系細胞」は,内皮(例えばHUVEC)または間葉系幹細胞(MSC)から選択されます。この三次元共培養プラットフォームは,長期のフォローアップ(継代培養を必要とせずに最大12週間の培養)と,アッセイに支障なく培養上清の繰り返しサンプリングが可能です。感染および化合物への経時応答は,予め定めた間隔での培地のサンプリングにより分析します。分析は,培地に分泌されるサイトカイン,SARS-CoV-2粒子またはウイルス成分(例えば,エンベロープ抗原やRNA)の負荷,凝固関連因子,および全体的なグルコース消費,またはカタボライトのレベルに適応します。

複数の三次元培養間のコミュニケーション

3D CoSeedisを用いた三次元培養を複数組み合わせることにより,非常に効率的で予測的な疾患モデリングの構築が可能となります。

COVID-19関連サイトカイン放出症候群における新規in vitro研究

個々の3D構造を自由に組み合わせることで,in vivoの状況を最もよく反映するモデルを作製できます。

このモデルによって,例えば以下のような事象の研究に応用できます。

  • 由来生物種の異なる細胞(例:生物間コミュニケーション)
  • 由来臓器の異なる浮遊細胞(例:血球)
  • 薬物化合物,感染性粒子,毒素などの生物学的に活性な薬剤に対するシステムの応答または反応

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3D CoSeedis 関連動画集

3D CoSeedis Chips - A new standard in 3D cell culture

Let cells do the work: New approaches to 3D culture models

Seeding cells in 3D CoSeedis-Tutorial

3D CoSeedis ChipTransfer 20200116

3D CoSeedis Tutorial Harvest 3DCS 20200110

abc biopply - 3D CoSeedis

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3D CoSeedis Chip200(#C200)

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3D CoSeedis Chip200
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均一で均質なスフェロイド・オルガノイドを容易に大量生産できるディスポーザブルチップ。6-wellプレートに適合し,1チップ当たり200個のスフェロイド・オルガノイドを生成可能。作製したオルガノイド ・スフェロイドは10週間以上の長期培養も可能。
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3D CoSeedis Chip880(#C880)

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3D CoSeedis Chip680(#C680)

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Spatula for 3D CoSeedis C200/C880, sterile
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3D CoSeedis Chip200 (#C200), Chip880 (#C880)に適したピンセット。
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Spatula for 3D CoSeedis C680, sterile
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3D CoSeedis Chip680 (#C680)に適したピンセット。
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3D CoSeedis Aggregation Medium 1 Kit incl. basal medium and supplement
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3D CoSeedis Aggregation Medium 1 Kit incl. basal medium and supplement

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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