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脂質二重膜の張力変化を蛍光寿命で検出する蛍光プローブ Flipper-TRシリーズ

掲載日情報:2021/03/05 現在Webページ番号:69125

Flipper-TRシリーズは、それぞれ細胞の原形質膜、および各種のオルガネラ(小胞、リソソーム、ミトコンドリア)の脂質二重層に特異的に挿入され、蛍光寿命の変化によりそれぞれの膜の張力変化を検出できる蛍光プローブです。これらの4種類の膜プローブは、同一の励起・蛍光波長(Ex 488 nm/Em 575~625 nm)を用いた多重標識実験にも適応します。生細胞の張力をリアルタイムで測定できます。

Flipper-TRを用いた膜の張力の検出方法

原形質膜張力の変化により、Flipper-TRプローブはねじれ型と平面型へ構造変化します。これにより蛍光基の位置も変化すると様々な蛍光寿命が生じるため、FLIM顕微鏡で検出することができます。

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脂質膜とFlipper-TRとは

脂質膜とは

脂質膜は動的で流動性のある厚さ4 nm程度の構造物です。細胞がその基本的な生理機能である移動や伸長、貪食、分裂等を行う際に、脂質膜は形状や張力を変化させる必要があります。その動的な性質を必要とされるがゆえに膜張力は常に一定の制御を受けており、そして膜張力は細胞増殖や成長、運動性、エンドサイトーシスや代謝を制御しています。膜の形状変化および張力変化は細胞内外の様々な場所で発生しており、細胞プロセスの制御を理解する上で重要なパラメーターです。

Flipper-TRとは

Flipper-TRを用いた膜の張力の検出方法

図1.Flipper-TRと細胞膜張力の相関図
Flipper-TRに含まれる2つのジチエノチオフェン(左)間のねじれ角変化および偏光変化により、脂質二重膜の構造変化を検出します。脂質二重膜の張力が低いとき、Flipper-TRはねじれ構造(中央)を取り、蛍光寿命は短くなります。一方、張力が高いときには平面構造(右)となり、蛍光寿命は長くなります。



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製品の種類

商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

品名 Flipper-TR Kit ER Flipper-TR Kit Lyso Flipper-TR Kit Mito Flipper-TR Kit
標的部位 原形質膜 小胞体膜 リソソーム膜 ミトコンドリア膜
商品コード CY-SC020 CY-SC021 CY-SC022 CY-SC023
測定機器 蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)
測定波長 励起 480 nm/蛍光 600 nm
測定フィルター 励起 488 nm/蛍光 575~625 nm
分子吸光係数(εmax) 1.66・104 mol-1・cm-1(DMSO)
蛍光寿命 2.8~7 ns
量子収量 30%(AcOEt)
包装 35 nmol


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特長

  • Flipper-TRは、細胞の形質膜に自発的に入り、脂質膜に挿入したときのみ蛍光を発しますが、水溶液ではほとんど蛍光を発しません。
  • 他の細胞膜プローブに比べて、バックグラウンドが低く抑えられています。
  • 染色に使用する濃度(1μM)で2~3日間培養しても細胞の生存率に与える影響はありません。そのため、血清を加えた状態での長時間イメージング(>24時間)の際に取り除く必要がありません。
  • 細菌や酵母、哺乳動物、植物等を含む広範な生物種に適用できます。
  • 組織切片や三次元培養した養細胞にも使用できます。

検出には蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)が必要です。
Flipper-TRは、スイスのUNIGEMの登録商標です。

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蛍光スペクトル

図2. Flipper-TRの吸収スペクトル(点線)および励起スペクトル(実線)



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使用例

Flipper-TR(#CY-SC020

細胞膜張力測定例

Flipper-TRで測定した膜の張力
  • 左図:Flipper-TRによる細胞膜(原形質膜)の染色。浸透圧ショック(OS)処理前(左上写真)と処理後(左下写真)で、それぞれ左側画像は蛍光強度(グレイスケール)、右側画像は蛍光寿命(カラーコード)を示す。
  • 右図:浸透圧ショックを与える前(灰色)と与えた後(赤色)の蛍光寿命に対する光子数のヒストグラム

Colom, A. et al.(2018)1から転載



浸透圧ショック処理した酵母細胞の蛍光寿命の変化の検出例

Flipper-TRで蛍光寿命の変化を検出した図

Flipper-TRによって染色した酵母細胞(中央)に、低浸透圧ショック(左)または高浸透圧ショック(右)を与え、蛍光寿命の変化を検出した。

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オルガネラ特異的Flipper-TR

ER Flipper-TR(#CY-SC021

ER Flipper-TR染色したHeLa細胞の蛍光寿命イメージング顕微鏡像

ER Flipper-TR染色したHeLa細胞の蛍光寿命イメージング顕微鏡像

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Lyso Flipper-TR(#CY-SC022

Lyso Flipper-TR染色したHeLa細胞の蛍光寿命イメージング顕微鏡像

Lyso Flipper-TR染色したHeLa細胞の蛍光寿命イメージング顕微鏡像

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Mito Flipper-TR(#CY-SC023

Mito Flipper-TR染色したHeLa細胞の蛍光寿命イメージング顕微鏡像

Mito Flipper-TR染色したHeLa細胞の蛍光寿命イメージング顕微鏡像

  • 上段:蛍光寿命
  • 中段:蛍光強度
  • 下段:ミトコンドリア収縮中の距離

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参考文献

  1. Colom, A., et al., Nat. Chem., 10(11), 1118~1125 (2018).[PMID:30150727
  2. Dal Molin M., J. Am. Chem. Soc., 137(2), 568~571 (2015).[PMID:25584496
  3. Soleimanpour, S., et al., Chem. Commun. (Camb)., 52, 14450~14453 (2016).[PMID:27901525
  4. Riggi, M., et al., Nat. Cell Biol., 20(9), 1043~1051 (2018).[PMID:30154550
  5. FLIM microscopy:Lakowicz, JR., Emerging biomedical and advanced applications of time-resolved fluorescence spectroscopy, J Fluoresc., 4(1):117~136 (1994).[PMID:24233306

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FAQ

Q-1. FLIM顕微鏡法とは何ですか?Flipper-TRではどのように機能しますか?

A-1. FLIM顕微鏡法は、蛍光寿命イメージング顕微鏡(Fluorescent Lifetime Imaging Microscopy)法の略です。
Flipper-TRによる膜張力測定法が確立される前は、膜張力の測定には非常に手間と設備を要しました。現在では、お手持ちのレーザー走査顕微鏡にPicoQuant upgrade kitなどの市販の時間分解光検出器を追加するだけで、比較的簡単に高感度の張力測定が可能になります。これにより、通常は1~10ナノ秒オーダーの非常に高速なフルオロフォアの励起後の発光時間を記録することが可能になります。FLIM顕微鏡の実験装置のより詳細な解説は、参考文献1をご参照下さい。

FLIM配置図

  • 左:顕微鏡メーカーから入手可能なFLIM顕微鏡の配置図
  • 右:細胞のFlipper-TR染色像。グレースケールで染色された細胞の画像は蛍光強度を表し、カラーコードは蛍光寿命を表す。

Colom, A. et al.(2018)1から転載


Q-2. Flipper-TRプローブは蛍光寿命を変化させますか?

A-2. 蛍光Flipper-TRプローブの最も先進的な特徴は、細胞の原形質膜を特異的に標的化し、蛍光寿命の変化をさせるこにより膜張力の変化を報告することです2~5。Flipper-TRは、自発的に細胞の原形質膜の脂質膜に挿入された場合にのみ蛍光を発します。Flipper-TRに含まれる2つのジチエノチオフェン(左)間のねじれ角変化および偏光変化により、脂質二重膜の構造変化を検出します。発光寿命は、緊張状態(ジチエノチオフェンが整列状態)では長く(4.1~8.0 ns)、緩和状態(ジチエノチオフェンはねじれ状態)では短くなります(2.0~4.0 ns)。分散(cv)は、0.3 ns(cv = ~15%)のオーダーであり、膜張力の微妙な変化を高解像度で解析できます。通常、寿命が短い場合は緑色、中程度の場合は黄色、長い場合はオレンジ色または赤色になります(図1参照)。


Q-3. Flipper-TRシリーズにはどのフィルターセットを使用するべきですか?

A-3. Flipper-TRプローブは、励起ピークが発光ピークより100 nm以上短いため、理想的な蛍光フィルターは長波長分離用:励起 488±20 nmと蛍光 575~675±40 nmのものです(図2参照)。時間分解測定法では、水性環境において蛍光が低いことに加え、非常に低バクグラウンドです。以下のQ4を参照して下さい。



Q-4. Flipper-TRプローブが他の原形質膜プローブと比較してバックグラウンドが低いのはなぜですか?

A-4. Flipper-TRプローブは、水溶液ではねじれ構造をとり、ほとんど蛍光を発しないため、バックグラウンドが非常に低くなります。組織培養培地中では、完全にねじれた状態であり、ミセルを形成してFlipper-TRプローブ自体を消光する傾向があるためです3。膜に挿入されるとねじれが少なくなり、高い蛍光を発し始めます(図1参照)。


Q-5. Flipper-TRプローブは室温で安定ですか?

A-5. はい。プローブは室温で数日間粉末状で安定しています。無水DMSO(DMSOの古い開封済みボトルは使用せず、Sigma社またはSpectrum Chemicals社の乾燥DMSOのアンプルを使用して下さい。)で再構成後は-20℃での凍結融解に対して安定していますが、お推めしません。この条件下における分解防止のために、小分けして保管して下さい。


Q-6. Flipper-TRは、細胞毒性がありますか?

A-6. いいえ、データシート記載条件下では、プローブは毒性がありません。細胞の種類と培養条件に応じ、2~4日間は細胞は生存および蛍光を発します。


Q-7. どのような生物や組織がFlipper-TRプローブで染色されますか?

A-7. 現在までのところ、組織培養細胞、組織切片、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌など、すべての既知の生物がFlipper-TRで染色されています。


Q-8. Flipper-TRプローブは三次元細胞培養で機能しますか?

A-8. はい、プローブは三次元増殖環境で細胞を染色することができます。


Q-9. 膜の量子収率と吸光係数を教えて下さい。

A-9. 量子収率= 0.30(in ethoxyethanol)です。

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価格表

[在庫・価格 :2024年03月01日 13時15分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
Flipper-TR Membrane Tension Probe (50 nmol)
1週間程度 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
細胞の原形質膜の脂質二重層に挿入され,蛍光寿命の変化により膜の張力変化を検出できる蛍光プローブ。染色に使用する濃度(1μM)で2~3日間培養しても細胞の生存率に与える影響は無い。
法規制等 医薬用外劇物
保存条件 -20℃,乾燥状態(デシケータ内)で保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2023年10月15日号 p.6
ニュース2020年12月1日号 p.12

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Flipper-TR Membrane Tension Probe (50 nmol)

文献数: 0

説明文 細胞の原形質膜の脂質二重層に挿入され,蛍光寿命の変化により膜の張力変化を検出できる蛍光プローブ。染色に使用する濃度(1μM)で2~3日間培養しても細胞の生存率に与える影響は無い。
法規制等 医薬用外劇物
保存条件 -20℃,乾燥状態(デシケータ内)で保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2023年10月15日号 p.6
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(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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