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生細胞のcGMP検出用蛍光バイオセンサー Green GENle cGMP Assay Kit

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:68590

GENIeセンサーは,cGMP (cyclic GMP)濃度の増加に対応して蛍光強度が減衰する蛍光タンパク質を応用した蛍光バイオセンサーです。この蛍光バイオセンサーは,蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡による画像解析システムを用いて,生細胞におけるcGMPの動的挙動の継時測定,局在性の観察およびマルチプレックスアッセイを簡便に行うことができます。また,PDE(phosphodiesterase)阻害物質の選択性の確認にも有用です。

Green GENle cGMP sensorをHEK293細胞に導入した。SNP(Sodium Nitroprusside )の添加によるcGMPの変化が,緑色蛍光により示される。

阻害物質添加前(左)および添加後(右)のHEK293T細胞

cGMPとPDE(Phosphodiesterase)阻害物質の選択性の確認

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cGMPとPDE(Phosphodiesterase)阻害物質の選択性の確認

cGMPは,光伝達,平滑筋弛緩およびシナプス可塑性を含む多くの細胞プロセスにおける重要な二次メッセンジャーです。GENIeは,生細胞のcGMPシグナリングを検出するようにデザインされた蛍光タンパク質遺伝子を用いた蛍光アッセイです。このアッセイは,PDE阻害物質の選択性の決定にも使用できます(下図参照)。 GENIeと異なる蛍光色のセンサーと併用することにより,複数のシグナルの同時測定することができます。蛍光はcGMPレベルの増加に対応して減少し,蛍光顕微鏡および自動蛍光プレートリーダーで容易に検出することができます。

下図のcGMP ProductionとPDE Inhibitionのそれぞれの部分をクリックすると,使用例をご覧いただけます


下表中のキット名をクリックすると製品の詳細,商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

キット名cADDis cAMP assayGENle cGMP assay
商品コードU0200GD0800G
阻害物質名IBMX (非選択的PDE阻害物質)の効果

IBMXの添加により,cAMPとcGMPの濃度はともに増加する。
PDE阻害物質の選択性の同定

cADDisとGENle assayの測定結果を比較することにより,PDE阻害物質の選択性を同定することができる。

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特長

  • cGMPの生成およびPDEの阻害機構の研究に最適です。
  • 生細胞において,継時的な応答を測定します。
  • BacMamベクターを用いて初代培養細胞およびiPSCに効率的に導入することができます。
  • 蛍光プレートリーダーまたはイメージングシステムを用いてmNeon greenの蛍光の変化をモニターします。
  • 測定波長:励起 506 nm/蛍光 517 nm

mNeon greenの蛍光スペクトル


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キット内容

  • Green GENIe cGMP sensor BacMam
  • Sodium butyrate, 500 mM in H2O
  • Sodium guanylate cyclase (sGC)
Monitor cGMP production or phosphodiesterase inhibition in living cells

測定には蛍光プレートリーダーまたはイメージングアナライザーが必要です。

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使用例

Bright green fluorescent sensor for cGMP

Monitor cGMP production or phosphodiesterase inhibition in living cells

Green GENle cGMPは,cGMP濃度の増加に対してmNEonGreenの蛍光強度が減少する。

GENle cGMP sensorの用量依存的蛍光強度および変化率の測定

Monitor cGMP production or phosphodiesterase inhibition in living cells

BacMam vectorに挿入されたGENleは,特定の細胞型に対して滴定により最適化することができる。この例では,HEK293T細胞に異なる用量のGENleを導入し,sGC BacMam 2μlとSNP (Sodium Nitroprusside) 30μMにより刺激し,生成したcGMPの蛍光強度およびその変化率を測定した(n=10 wells per condition)。

SNPの刺激によるcGMP生成の測定

Monitor cGMP production or phosphodiesterase inhibition in living cells
BacMam vector(sGC BacMam 2μlとGENle 25μl)をHEK293T細胞に導入し,SNPにより刺激した後に96well plateを用いてcGNPの生成を蛍光強度により測定した(使用機器:Biotek Synergy MX plate reader)。

HEK293T細胞におけるcAMP(赤色)とcGMP(緑色)の同時測定

Simultaneous measurements

HEK293T細胞にcADDis cAMP BacMamとGreen GENle cGMPのそれぞれのプラスミドを同時に導入し,300μMのNO-sensitive guanylyl cyclase Sodium Nitroprusside(SNP)(左)で刺激し,また1μMのIsoproterenol(右)でB2ARを刺激し,24時間後にそれぞれの蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。SNPによる刺激した場合は,cGMPの濃度は継時的に増加するが,cAMPはほとんど増加しなかった。一方,Isoproterenolで刺激した場合では,cGMP濃度はほとんど変化しなかったが,cAMP濃度は添加直後に顕著に増加することがわかる。

GENleを用いたPDE阻害物質の検出

PDE阻害物質の検出

PDE阻害物質のSildenafilは,GENleの蛍光を増加させる。このことは,cGMPの分解が阻害された際にcGMP濃度がより速く増加することを示している。HEK293T細胞に25μlのGENleを導入後,内因性sGCを30μMのSNPの添加によって活性化した(n=5 wells per condition)。

GENleとcADDisセンサーの比較によるPDE阻害物質の選択性の決定

ion in living cells
  • IBMX:non-selective inhibitor
  • Sildenafil:selective inhibitor of cGMP-specific PDE5
  • Rolipram:selective inhibitor of cAMP-specific PDE4
  • (n=4 per condition)

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操作方法概略

操作方法概略
  1. 細胞を播種する。
  2. BacMam(ウイルスベクター)と添付のSodium butyrateを培地に混ぜて細胞に添加し,室温で30分間インキュベートする。
  3. 通常の細胞培養条件下で24時間培養する。
  4. 培地をDPBSに交換する。
  5. 室温下で20~30分間プレートを静置する。
  6. SNPまたは他の酸化窒素ドナーを添加する。
  7. 蛍光プレートリーダーまたは蛍光顕微鏡で継時的に測定および観察を行う。

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価格

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(テクニカルサポート 試薬担当)

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