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DNA特異的な細胞核ライブイメージング試薬 NucleoSeeing <Live Nucleus Green>

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:68107

フナコシ /
フナコシ株式会社

NucleoSeeingはDNA特異的に結合し緑色蛍光を発するライブイメージング用核染色試薬です。動物細胞・組織のみならず,シロイヌナズナの葉細胞においても高いS/N比を示し,生細胞における核動態観察に優れています。また,核内pHセンシングへの応用も可能です。
本製品は名古屋工業大学の研究成果を元に製品化されました。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


使用例

NucleoSeeingを用いた各種試料の染色例
HeLa細胞(左),シロイヌナズナ表皮細胞および孔辺細胞(中),マウス脳海馬のスライス培養組織(右)をそれぞれ生細胞イメージングで観察した。詳細は各データ例をご覧下さい。


生細胞における細胞核イメージング

細胞核はDNAの貯蔵庫として細胞分裂や遺伝子発現制御などを担う,細胞で最も重要なオルガネラのひとつです。そのため,細胞核のダイナミックな動態をライブイメージングで観察することは,非常に重要な課題とされています。古くよりさまざまな核染色試薬が開発されており,核酸応答性の青色蛍光色素であるHoechstシリーズやDAPIが広く活用されていますが,これら青色蛍光色素は励起光として紫外光を用いるため,光毒性が強く生細胞イメージングに適用できない問題がありました。近年,生細胞に適用可能な核染色試薬として緑色蛍光色素や赤色蛍光色素がいくつか開発されていますが,化合物の細胞毒性や核特異的染色性に課題があるとされています。

NucleoSeeing は名古屋工業大学 築地真也教授らにより開発されたDNA特異的な緑色蛍光性化合物で,培養細胞,培養組織およびシロイヌナズナの葉の細胞など植物細胞において,生細胞イメージングが可能です。本製品は細胞毒性が低く,DNA特異的な高いS/Nを示すため,優れた細胞核染色性を示します。固定細胞の観察も可能で,柔軟なアプリケーションを計画できます。
さらに,ユニークなpH依存的な蛍光特性を持ち,細胞核特異的なpHセンシングにも応用可能です。近年,核内pHの重要性が議論される中,核内pH測定の専用試薬としても期待されています。
核内pH測定についてはこちらをご覧下さい。


各種細胞核染色用試薬の比較

染色試薬名光特性化合物の物性観察方法
測定波長
励起/蛍光(nm)
蛍光色光毒性核特異性細胞膜透過性細胞毒性生細胞固定細胞
NucleoSeeing488 / 520低い高い透過低い
Hoechst350 / 461高い高い透過高い
DAPI350 / 461高い高い不透過不明×
X社製品485 / 498低い透過不明
Y社製品646 / 680低い高い透過高い

光毒性:光照射による細胞毒性


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原理

NucleoSeeingは膜透過性を有する緑色核染色試薬で,緑色蛍光色素とDNA特異的結合タグから構成されています。本試薬はDNAの非存在時は折り畳まれた構造を示し,消光状態にありますが,DNA結合時に構造が変わり,緑色蛍光を発することを利用しています。NucleoSeeingは細胞内に取り込まれた後,DNAに結合時のみ緑色蛍光を発するため,細胞核を特異的に観察することが可能です。

模式図

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特長

  • DNA結合時のみに緑色蛍光を発し,高いS/N比を示します。培地中では消光しているため,培地に添加した状態でも高感度な観察が可能です。
    感度を上げたい場合は,染色後に培地交換して観察することを推奨しています。
  • 励起/蛍光波長:488 nm / 520 nm
  • 従来のHoechstなどの試薬と比べ,細胞毒性がほとんど見られません。
  • 培地に本試薬を添加した状態であれば長時間イメージングが可能です。
  • FBSの影響が少なく,10%FBS条件下でも良好な染色が可能です。
    FBS存在下では,試薬濃度を上げる必要があります(下記「FBSの影響について」を参照)。
  • 生細胞イメージングのみならず,固定細胞での染色や,生細胞イメージング後に細胞を固定して観察することも可能で,免疫染色実験にも利用可能です。
  • 動物由来培養細胞・組織,植物細胞(シロイヌナズナ葉細胞)で実績があり,いずれも高いS/N比で核染色が可能です。
  • 植物細胞の観察時,葉緑体由来の自家蛍光(Em:>615 nm)の影響を受けず,核のみを可視化することが可能です。
  • 可逆的な染色が可能です。本試薬で染色後に培地交換することで,培地交換後12~24時間程度でほぼ完全に細胞外に排出されます。
  • pH依存的な蛍光強度の変化が見られるため,pH6~8の間では,2波長の蛍光強度比(Ex 405 nm, Em 520 nm / 460 nm)を取ることで核内pHセンサーとして利用できます。

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アプリケーション

  • 動物由来培養細胞の生細胞イメージング
  • 植物細胞の生細胞イメージング
  • 免疫染色における核染色
  • 核内pHセンサー(pH 6~8)

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原著論文

本製品NucleoSeeingは,下記論文中のhoeAc2FLです。


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データ例

DNA応答性の蛍光特性と核特異的染色

左:NucleoSeeingはDNA存在時にのみ強い緑色蛍光を示す。励起488 nm。
右:生細胞において,DNA特異的な結合試薬であるHoechst33342(青)とNucleoSeeing(緑)で共染色を行ったところ,高い一致が見られた。

核特異的

細胞毒性

青色核染色試薬として汎用されるHoechst33342とNucleoSeeingの細胞毒性をMTTアッセイにより確認した。Hoechstは5μMで著しい細胞死が観察されたのに対し,NucleoSeeingでは少なくとも5μMまで細胞毒性が観察されなかった。

細胞毒性

可逆的な染色

Hoechst33342およびNucleoSeeingの細胞滞留性を評価するため,各試薬1μMで15分間処理後,培地交換して余剰な試薬を除去し,24時間の蛍光強度の変化を観察した。Hoechst33342は24時間後でも80%程度の蛍光強度が維持され不可逆性を示したのに対し,NucleoSeeingは時間依存的に蛍光強度が減衰し,12時間以降ほぼ全量が排出された。NucleoSeeingは可逆的な核染色試薬として使用できることが示された。

可逆的な染色

さまざまな培養細胞の核染色

さまざまな培養細胞に対し,NucleoSeeing 1μMを培地に添加し15分染色後,培地交換して生細胞で観察した。いずれの細胞でも核特異的なシグナルが観察された。

培養細胞の核染色

長時間タイムラプスイメージング



HeLa細胞をガラスボトムディッシュに播種し20時間後,0.5μM NucleoSeeing in DMEM (+10%FBS)で1.5時間処理し,未洗浄条件下にて10分間隔で計20時間,共焦点レーザー顕微鏡にてタイムラプスイメージングを行った(Ex. 488/ Em. 500-600 nm, 60x oil lens)。有糸染色体分裂の様子が観察され,細胞が増殖する過程が観察できた。
注意:本試薬で長時間ライムラプスイメージングを行う際は,培地交換をせず,本試薬を培地に含んだ状態で観察することを推奨しています。

⇒動画を再生できない場合は,こちらをご参照ください。



マウス脳(海馬)スライス培養組織の染色例

マウス脳海馬のスライス培養組織に対し,NucleoSeeingを20μM培地に添加し15分染色後,培地交換して未固定条件で観察した。

マウス脳染色

FBSの影響について

培地中のFBSの影響を評価するため,FBS(10%)の有無の条件においてNucleoSeeingで染色し際の蛍光強度を共焦点レーザー顕微鏡により観察した(Ex. 488/ Em 500-600 nm)。画像取得条件(励起光レーザーパワーおよび蛍光検出感度)は同一とした。NucleoSeeing濃度を1 μM条件にした場合、FBS添加により蛍光強度減少が観察された。FBS存在下では、試薬濃度を上げることで核染色性は改善した。
注意:本試薬はFBS存在下でも使用可能ですが,FBS無添加条件に比べ染色性の低下が見られるため,事前に本試薬濃度の条件検討を推奨しています。

FBSの影響について

固定細胞における染色例

左:HeLa細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定処理後,細胞をPBSで洗浄し,NucleoSeeing 1μMを添加して15分染色を行った。染色後,洗浄し観察した。
右:HeLa細胞をNucleoSeeing 5μMを添加して15分間染色後,4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し観察した。
メタノール固定も実施可能ですが,シグナルが減弱することがあります。

固定細胞脳染色

シロイヌナズナの葉の孔辺細胞の染色例

シロイヌナズナの葉の切片について,NucleoSeeing 20μMで60分間処理した後,切片を洗浄し,観察した。励起光 488 nmにおいて,緑色蛍光領域490~555 nmでは閉口状態の孔辺細胞の核が観察され,615 nm以上の波長領域では葉緑体由来の自家蛍光が観察された。本試薬を用いることで,葉緑体の自家蛍光と切り分けて細胞核が観察でき,植物細胞の核動態イメージング試薬として期待されています。
シロイヌナズナの孔辺細胞における核染色は,名古屋工業大学 築地教授らと東北大学 上田実教授らとの共同研究により見出されました(原著文献2)。2020年の最新の研究では,孔辺細胞において気孔が閉じている時に特異的に染色され,気孔の開口により脱染色されることが報告されています。この現象を利用し,本試薬を用いた簡便かつハイスループットな気孔開閉評価法が提案されています。詳細は原著文献4をご参照下さい。

ナズナ孔辺細胞染色

シロイヌナズナの表皮細胞の染色例

シロイヌナズナの葉の切片について,NucleoSeeing 20μMで60分間処理した後,切片を洗浄し,観察した。表皮細胞の核特異的な染色が確認された。

ナズナ表皮細胞染色


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NucleoSeeingを用いた核内pHセンシング

細胞核は核膜と呼ばれる外膜と内膜の2枚の脂質二重膜からなる特殊な膜構造を有しており,細胞質とは隔離されています。核内と細胞質の物質のやり取りは核膜孔を介して行われますが,核内と細胞質の環境は異なると考えられています。近年,核膜には核膜特異的なプロトンポンプ(H+-ATPase)が存在し,核と細胞質の間にプロトン勾配を生み出すことが示唆されています。生理現象に応じた核内のpHの変化の測定が期待されていますが,これまで十分な試薬は開発されてきませんでした。
名古屋工業大学 築地教授らはNucleoSeeingがpH依存的な蛍光特性を有することを明らかにし,核内pHセンシングツールとして使用できることを報告しています。NucleoSeeingは核染色試薬として,通常は励起光480 nm/蛍光 520 nmで使用しますが,励起光 405 nmを使用すると460 nm付近,および520 nm付近の蛍光がpHに依存して変化します。励起光 405 nmにおける 460 nmおよび520 nmの蛍光強度比(F520 / F460)を測定することで,pH5.5~8.5の間でシグモイド曲線が観察されます。この原理を利用することで,細胞核内のpHセンシングが可能です。

■ 原著論文
Nakamura, A. and Tsukiji, S., Bioorg. Med. Chem. Lett., 27 (14), 3127~3130 (2017)
"Ratiometric fluorescence imaging of nuclear pH in living cells using hoechst-tagged fluorescein."


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NucleoSeeingによる細胞核内pHセンシングの原理と特長

(参考データ)in vitroにおけるNucleoSeeingのpH依存的な蛍光特性

左:NucleoSeeingの励起波長405 nmにおける蛍光スペクトルとpH依存性。pH5.5~8.5の間では,460 nm周辺および520 nm周辺の蛍光強度がpH低下とともに増加する。
右:各pHにおける,460 nmおよび520 nmの蛍光強度F(励起波長 405 nm)と蛍光強度比(F520 / F460)。
<注>NucleoSeeingは生細胞用に細胞膜透過性が最適化されており,細胞内に取り込まれた後,エステラーゼにより加水分解され,活性本体に変換されます。本データは検証用に化学合成した活性本体(NucleoSeeingの加水分解体)を用いてin vitroで測定したものです。NucleoSeeingをそのままin vitroで使用しても本データを再現できませんのでご注意下さい。

pH依存的な蛍光特性

in celluloにおけるNucleoSeeingによる核内pH観察

培養細胞(HeLa細胞)をNucleoSeeing で染色後,K+/H+イオノフォアNigericinを含む各pHバッファーで培養後,励起光405 nmにおける蛍光強度比(FFluorescein / FHoechst)を共焦点顕微鏡により観察した。
左:各pHにおける蛍光観察像
右:定量解析結果
in vitroと同様に,pH依存的な蛍光強度比の応答が観察され,生理的(Nigericin非添加時)な核内pHが7.4と見積もられた。
Nigericinは代表的なK+ / H+イオノフォアで,細胞外溶液のpHと細胞内pHをそろえる際に使用される。

核内pH観察

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価格

[在庫・価格 :2020年07月04日 00時13分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
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納期 文献数
NucleoSeeing <Live Nucleus Green>
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説明文
DNA特異的に結合し緑色蛍光を発するライブイメージング用の細胞核染色試薬。核特異性が高く,低毒性で,動物細胞・組織,シロイヌナズナの葉細胞において実績がある。核内pHセンシングへの応用も可能。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2020年4月1日号 p.24
ニュース2020年3月15日号 p.22

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説明文 DNA特異的に結合し緑色蛍光を発するライブイメージング用の細胞核染色試薬。核特異性が高く,低毒性で,動物細胞・組織,シロイヌナズナの葉細胞において実績がある。核内pHセンシングへの応用も可能。
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掲載カタログ ニュース2020年4月1日号 p.24
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(テクニカルサポート 試薬担当)

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