細胞内のポリアミンを検出する蛍光性試薬 PolyamineRED^®（Intracellular Polyamine Detection Reagent）

* 総ポリアミンを検出するため、個々のポリアミン類の定量はできません。

PBS中におけるPolyamineRED^®のみ（黒）およびPolyamineRED^®+spermine（赤）の吸収スペクトル（点線）と蛍光スペクトル（実線）。ポリアミンの有無で蛍光スペクトルに変化がないことが分かる。

※ メタノール固定はポリアミン成分が細胞外に漏出する恐れがあるため、お勧めいたしません。

3種類のがん細胞（MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3）と2種類の非がん細胞（MCF10A, リンパ球）に30μMのPolyamineRED^®を10分間処理し、PBSで3回洗浄し、DAPI染色後に細胞をホルマリン固定した。がん細胞で有意にTAMRAのシグナルが見られた。一方、非がん細胞にはポリアミン量が少ないため、MCF10やリンパ球ではTAMRAのシグナルがほとんど検出されなかった。

MDA-MB-231に30μMのPolyamineRED^®を10分間処理後、DAPI染色し、細胞を固定した。MDA-MB-231では、ポリアミンは細胞質よりも核内から強く検出された。PolyamineRED^®を用いることで、細胞内ポリアミンの局在を評価できる。

786-O細胞を24ウェルプレートに播種し、1日培養したのち、コンフルエント条件下で無血清DMEM培地中にオルニチン合成酵素阻害物質DFMO（1 mM）を添加し16時間処理した。そこに終濃度20 μM PolyamineRED^®またはTAMRA（ネガティブコントロール）を追添加し、4時間反応させた。細胞をPBSで3回洗浄後、1% SDSを含むPBSを添加し、細胞ライセートを調製した。各細胞ライセートを蛍光分光光度計で蛍光強度（Ex 540±10 nm/Em 585±20 nm）を測定した。PolyamineRED^®を処理した細胞ライセートの蛍光強度はネガティブコントロールとして実施したTAMRA処理細胞ライセートに比べて顕著に優位であり、細胞ライセートでも十分な特異的シグナルが検出できた。また、DFMOにより大きくシグナルが減衰したため、ポリアミンの生合成が抑えられたことがわかる。

786-O細胞を96ウェルプレートに播種し、1日培養したのち、コンフルエント条件下で各種薬剤をフェノールレッド不含DMEM培地中に添加し16時間処理した。そこに終濃度10 μM PolyamineRED^®またはTAMRA（ネガティブコントロール）を追添加し、4時間反応させた。細胞をPBSで3回洗浄後、新しいPBSを添加し、蛍光プレートリーダー（透過型測定）で蛍光強度（Ex 545±5 nm/Em 585±10 nm）を測定した。PolyamineRED^®を処理した細胞の蛍光強度はネガティブコントロールとして実施したTAMRA色素に比べて顕著に優位であり、蛍光プレートリーダーでも十分な特異的シグナルが検出できた。