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内在性のAMPA型グルタミン酸レセプター(AMPAR)ライブセルイメージング試薬 LiveReceptor AMPAR

掲載日情報:2018/03/26 現在Webページ番号:67801

フナコシ /
フナコシ株式会社

LiveReceptor AMPARは,生細胞でAMPA型グルタミン酸レセプター(AMPA Receptor; AMPAR)を特異的にフルオレセイン標識するタンパク質標識試薬です。生細胞で内在性のAMPARを標識できるため,ライブセルイメージングによる生理的なAMPARの挙動解析に優れています。

本製品はフナコシ株式会社が京都大学工学研究科 浜地教授の研究成果に基づき製品化したものです。
本製品は研究用です。臨床用途には使用できません。

神経細胞

初代培養海馬神経細胞にLiveReceptor AMPARを添加し培養すると、内在性AMPARにフルオレセインを標識できる。LiveReceptor AMPARにより生きたままの神経細胞のAMPARを可視化することができた。

受容体のライブセルイメージング手法の問題点とリガンド指向性タンパク質標識


MEMO

受容体のライブセルイメージング手法の問題点とリガンド指向性タンパク質標識


標識イメージ

■リガンド指向性タンパク質標識

従来の問題点を克服するために,京都大学工学研究科の浜地教授・清中准教授らは,タンパク質表面反応基acyl imidazoleにより内在性の標的受容体タンパク質のみを蛍光標識する技術を確立しました(図下段)。この方法では,特異的リガンドが標的受容体タンパク質に結合したときのみ,タンパク質表面反応基acyl imidazoleが活性化され,標的受容体タンパク質に選択的に蛍光標識することが可能です。続いて培地交換により余剰なリガンドや反応断片を除去できるため,リガンド結合部位が空いた状態の生理的な受容体タンパク質の挙動を観察することができます。

参考文献

  • Fujishima, et al., J. Am. Chem. Soc., 134, 3961~3964 (2012).
  • Miki, et al., Chem. Biol., 21, 1013~1022 (2014).

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LiveReceptor AMPARとは

LiveReceptorは,神経伝達物質受容体を標的としたリガンド指向性タンパク質標識試薬です。LiveReceptor AMPARは,AMPA型グルタミン酸レセプター(AMPAR)に対する世界初の特異的フルオレセイン標識試薬1です。記憶の分子メカニズムの中心的な役割を果たすと考えれられているAMPARの挙動解明に有用で,脳神経の基礎研究はじめ神経・精神疾患研究などの治療薬開発に優れた試薬として期待されています。

参考文献:
1. Wakayama, et al., Nat. Commun., 8, 14850 (2017). [PMID : 28387242 ]
Chemical labeling for visualizing native AMPA receptors in live neurons.

LiveReceptor AMPARは文献内のCAM2(Fl)です。

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特長

  • 内在性AMPARにフルオレセインを標識できます。
  • AMPAR(GluA2-4サブユニット)に高い特異性があり*,他のイオンチャネル型グルタミン酸レセプター(NMDA型グルタミン酸レセプター,カイニン酸型グルタミン酸レセプター)は標識されません。
  • 培地に添加し,1~4時間の標識反応後に,AMPARのライブイメージングが可能です。
  • 膜透過性がないため,細胞表面のAMPARのみを標識することができます。
  • 培養神経細胞,培養脳スライス組織およびAMPAR(GluA2, GluA3またはGluA4サブユニット)を過剰発現させた株化細胞で実績があります。
  • 低分子のため組織浸透性が高く,脳組織の急性スライス切片では深部まで標識実績があります。
  • 標識後もAMPARのイオンチャネル機能が維持されることが電気生理学的手法で確認されています。
  • 推奨使用濃度1μMでは,細胞毒性がほとんどありません。
  • 蛍光色素としてフルオレセインを用いているためpH応答性があり,インターナリゼーションされた標識AMPARは消光する傾向があります。細胞表面AMPARの観察に最適です。
  • ライブセルイメージングをはじめ,様々なアプリケーションに使用可能です。詳しくは下記データ使用例をご覧下さい。

* GluA1サブユニットは標識されないため,GluA1ホモマーは可視化できません。

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アプリケーション

  • ライブセルイメージング
  • ウエスタンブロット(抗フルオレセイン抗体)
  • 免疫沈降(抗フルオレセイン抗体)によるAMPAR結合タンパク質の解析・探索
  • 免疫染色(他の因子に対する抗体と共染色が可能)
  • 拮抗型阻害物質の探索および活性評価

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使用例

神経細胞のライブイメージング

神経細胞

初代培養海馬神経細胞にLiveReceptor AMPARおよび蛍光標識リガンド(FL-ligand; ネガティブコントロール)を1μMで添加した条件下で30分間培養し,培地交換の後ライブイメージングを行った。蛍光標識リガンドでは神経細胞の形態を観察することができなかったのに対し,LiveReceptor AMPARでは神経細胞の形態および樹状突起スパイン構造が観察できた。

培養スライス組織のライブイメージング

培養スライス組織

海馬の培養スライス組織に,AMPAR特異的な拮抗阻害物質NBQX(10μM)の存在下・非存在下でLiveReceptor AMPAR(1μM)を添加した。1時間培養し,培地交換後にライブイメージングを行った。
NBQX非存在下(左):樹状突起スパイン構造の蛍光シグナルが観察された。
AMPAR特異的阻害物質NBQX存在下(右):蛍光シグナルが消失した。
NBQXがAMPARのリガンド結合部位に競合していることを示し,LiveReceptor AMPARによる蛍光シグナルがAMPAR特異的なものであることがわかる。

AMPARに対する特異性

特異性

A:特異性の検証
LiveReceptor AMPARを用いてFluoresceinを導入後,細胞を破砕し抗Fluorescein抗体(anti-FL)を用いたウエスタンブロット法で検出したところ,AMPARのGluA2サブユニットに相当する105 kDaにシングルバンドを得た。このバンドはAMPARの特異的阻害物質NBQXで消失したことから,AMPARに特異的であると判断できる。

B:免疫沈降による特異性の証明
LiveReceptor AMPARによりFluorescein標識されたタンパク質を同定するため,抗Fluorescein抗体(anti-FL)を用いて免疫沈降を行ない,各グルタミン酸レセプターサブユニットに対する特異的抗体でウエスタンブロットを行った。AMPA型グルタミン酸レセプターのサブユニットであるGluA2でのみ濃縮が見られ,他のGluN(NMDA型グルタミン酸レセプター:NMDAR)やGluK(カイニン酸型グルタミン酸レセプター:KAR)では,免疫沈降による濃縮が見られなかった。

C:免疫染色による抗GluA2抗体染色像との比較
LiveReceptor AMPARにより生細胞でFluoresceine標識後,細胞を固定し,抗GluA2抗体を用いた免疫染色を行った。LiveReceptor AMPARによる染色像と抗GluA2抗体を用いた染色像が,よく一致していることがわかる。

組織深部の観察

組織深部

スライス培養のマウス脳をLiveReceptor AMPARで標識した後,組織を固定し,抗GluA2/3抗体で免疫染色を行った。x-y平面像では両者はよい一致を示すが,黄色ライン部分のx-z断面をみると,抗体は組織浸透性が低く,スライス表面しか染色できなかった。LiveReceptor AMPARは組織深部まで浸透するため,組織深部のAMPARを標識することができた(黒矢印:スライスの上端,白矢印:スライスの下端)。

FRAP解析によるAMPARの挙動解析

挙動解析

LiveReceptor AMPARを用いて神経細胞の内在性AMPAR標識し,細胞膜上におけるAMPARの輸送速度をFRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) 法により解析した。迅速な蛍光の回復が観察された。
Recovery ratio:16%,diffusion coefficient:0.090μm2s-1

薬剤処理によるシナプス可塑性の観察

シナプス可塑性

培養海馬神経細胞をLiveReceptor AMPARで標識した後,NMDA(50μM)を10分間処理し,化学的にLTD(Long-term depression;長期抑圧)を誘導した。LTD誘導条件では,樹状突起スパインにおける標識AMPARの量が顕著に減少していることを観察できた。

拮抗阻害物質探索スクリーニング

拮抗阻害物質探索

A:LiveReceptor AMPARは,AMPAR特異的なリガンドを利用し標識するため,AMPARのリガンドに拮抗する阻害物質・アンタゴニスト(competitive antagonist)の探索に利用できる。
LiveReceptorによる標識は,AMPAR特異的な阻害物質であるNBQXで著しく阻害されることが細胞,組織で確認できた。
B上段:AMPAR過剰発現細胞,B下段:組織

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価格

[在庫・価格 :2018年09月25日 23時06分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名 商品コード メーカー 包装 価格 在庫 納期 文献数 リスト
LiveReceptor AMPAR <Endogenous AMPAR Labeling Reagent>
データシート
FDV-0018A FNAフナコシ
フナコシ株式会社
10 μg ¥60,000 3個以上 - 0 追加

説明文 LiveReceptor AMPARは生細胞でAMPA型グルタミン酸レセプター(AMPA Receptor; AMPAR)を特異的にフルオレセイン標識するタンパク質標識試薬です。生細胞で内在性のAMPARを標識できるため,ライブセルイメージングによる生理的なAMPARの挙動解析に優れています。
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ

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[在庫・価格 :2018年09月25日 23時06分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。

LiveReceptor AMPAR <Endogenous AMPAR Labeling Reagent>

文献数:0


  • 商品コード:FDV-0018A
  • メーカー:FNA
  • 包装:10μg
  • 価格: ¥60,000
  • 在庫:3個以上
  • 納期:-

説明文 LiveReceptor AMPARは生細胞でAMPA型グルタミン酸レセプター(AMPA Receptor; AMPAR)を特異的にフルオレセイン標識するタンパク質標識試薬です。生細胞で内在性のAMPARを標識できるため,ライブセルイメージングによる生理的なAMPARの挙動解析に優れています。
法規制等
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お問い合わせ先(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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