AGCファミリー好塩基性タンパク質キナーゼの阻害物質探索に最適なキット ARC-Lum/Fluo Protein Kinase Assay Kits

AGCファミリーのプロテインキナーゼ（PKA, ROCK I, ROCK II, AKT3, PKG Iα, PKCδ, MSK1、Pim 1、CK2など）活性を、TR-FRET（Time-resolved fluorescence）（#BAS-LUM590）または蛍光偏光法（#BAS-FLUO590）で簡便かつ迅速に測定するキットです。従来のタンパク質キナーゼアッセイとは異なり、AGCファミリー好塩基性タンパク質キナーゼ活性の包括的な検出が行えるため、 ATPおよび基質に対するプロテインキナーゼの競合阻害物質のスクリーニングに特に有用です。

※関連製品「ARC(CK2)-Fluo Protein Kinase CK2 Assay Kit」については、こちらをご覧下さい。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

ARC-Lum/Fluo Protein Kinase Assay Kitsの操作方法概略

左：発光プローブARC-LUM590：ROCKⅡ複合体の競合阻害物質による置換作用
右：ROCKⅡを用いた蛍光プローブARC-FLUO590の検量線

※ お手持ちのプレートリーダーがTR-FRETおよび蛍光偏光法の両方に対応している場合、高感度で バックグラウンドが低いARC-Lum Kinase Assay Kit（#BAS-LUM590）の使用をお推めします。

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（1）ARC-Lum Kinase Assay Kit (#BAS-LUM590)

AGCファミリーのプロテインキナーゼはATP結合部位と基質認識部位をもちます。BAS-LUM590プローブは、ATPと基質結合部位に同時に結合し（二基質特性）、 近紫外線（300～360 nm）のパルス励起により590 nmのタンパク質誘導性のμ秒スケールの発光シグナルを発します。PK：BAS-LUM590複合体のBAS-LUM590プローブが競合阻害物質（C）に置換されると、マイクロプレートリーダーのTGL（time-gated luminescence）により励起される発光シグナルは消失します。高濃度（100 nM以上）遊離BAS-LUM590プローブ存在下でも発光シグナルは影響されないため、検出されるシグナル量はBAS-LUM590－プロテインキナーゼ複合体総量に正比例します。この特性を利用することで、従来の基質リン酸化阻害ベースのアッセイでは正確な測定ができなかった化合物（例えば、数種のキナーゼに対するKi値が1 nM以下のStaurosporine）などの結合親和性の決定も可能になります。

（2）ARC-Fluo Protein Kinase Assay Kit (#BAS-FLUO590)

AGCファミリーのプロテインキナーゼに高い親和性を有する蛍光プローブBAS-FLUO590は、溶液中で基質との結合した高分子（M.W.：＞40,000）状態では強い蛍光偏光（Ex 540 nm / Em 590 nm）を発します。競合阻害物質（C）存在下では、BAS-FLUO590が置換されて遊離型の低分子（MW＜2,000）となるため、ブラウン運動による高速回転が可能となり蛍光偏光が減少します。この蛍光強度の差異から、試験物質のプロテインキナーゼに対する阻害活性を求めることができます。

左：プロテインキナーゼPKAc・プローブARC-FLUO590複合体に対する各種阻害物質との置換による蛍光偏光測定結果
右：プロテインキナーゼROCK II・プローブARC-FLUO590複合体に対する各種阻害物質との置換による蛍光偏光測定結果

※ NAC - normalized anisotropy change

* 0.2 mM CaCl2, 10μg/ml DAG(diacylglycerol), 50μg/ml PS(phosphatidylserine)、0.015% Triton X-100