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疾患モデル細胞株 ゲノム編集済み細胞株(Isogenic Cell Line)

掲載日情報:2019/05/16 現在Webページ番号:64904

ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いて特定の遺伝子に変異導入を行った,遺伝的背景が親株と同じ(isogenic)細胞株です。疾患モデル細胞株は,腫瘍の分子および細胞メカニズムの研究,およびがんの創薬スクリーニングにおいて有用です。

特長

  • 正確なゲノム編集が行われています。
  • 一般的なヒト腫瘍細胞株を編集しています。
  • 疾患および薬剤ターゲットに強い関係性があります。
  • ゲノムレベル,転写物レベル,およびタンパク質レベルで検証しています。
  • 特異的な阻害物質で生物機能特性を検証しています。
  • 創薬スクリーニング用に有用です。
ゲノムレベルと転写物レベルの検証 タンパク質発現と機能検証
・サンガー法シークエンシング
・次世代シークエンシング(NGS)
・PCR法とRT-PCR法
・ウエスタンブロット法
・薬剤反応試験
・その他の生物機能的アッセイ


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Isogenic Cell Line

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品名
(Isogenic Cell Line)
導入した変異 親細胞株 由来 病種 モデルとなるがん 包装 ATCC®No.
(商品コード)
EML4-ALK Fusion-A549 EML4-ALK fusion A549 肺上皮 非小細胞肺がん 遺伝子転座
ALK阻害物質感受性変異体
1.0 ml CCL-185IGTM
KRAS Mutant-A375 KRAS G13D A375 皮膚上皮 メラノーマ BRAF阻害物質耐性変異体 ≧1×106 cells CRL-1619IG-1TM
NRAS Mutant-A375 NRAS Q61K A375 皮膚上皮 メラノーマ BRAF阻害物質耐性変異体 約2~3×106 cells CRL-1619IG-2TM
MEK Mutant-A375 MEK Q56P A375 皮膚上皮 メラノーマ BRAF阻害物質耐性変異体 ≧1×106 cells CRL-1619IG-3TM
IDH1 Mutant-U-87 MG IDH1 R132H U-87 脳上皮 神経膠腫 ドライバー遺伝子変異体 ≧1×106 cells HTB-14IGTM
IDH2 Mutant-TF-1 IDH2 R140Q TF-1 骨髄赤芽球 急性骨髄性白血病(AML) ドライバー遺伝子変異体 ≧1×106 cells CRL-2003IGTM


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ゲノムレベルと転写物レベルでの検証法

ゲノム編集済み細胞株(Isogenic Cell Line)NRAS Mutant-A375 cell line(ATCC® CRL-1619IG-2TM)におけるゲノムレベルと転写物レベルでの検証例です。position 61におけるグルタミンのリジンへの点変異がサンガー法シークエンシングによるクロマトグラムで示された(下図)。その他にもNGSと阻害物質による実験によって確認は行われた(結果は未表示)。

遺伝子レベルと転写物レベルの検証法

A):NRASQ61K点変異導入体のゲノムレベルでの検証
左図:変異導入部位とスクリーニングに用いたPCRプライマーの模式図。
右図:シークエンシング結果。C>A変異導入部位を赤枠で示した。

B):NRASQ61K点変異導入体の転写物レベルでの検証
細胞からmRNA抽出⇒cDNA抽出⇒PCRを行った。
上図:プロセッシング後のmRNAとPCRプライマーの模式図。
左図:PCR産物の電気泳動像。
右図:シークエンシング結果。変異導入部位を赤枠で示した。

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EML4-ALK Fusion Isogenic Cell Lineの検証結果例

MEMO

Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK)とは


Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK:未分化リンパ腫キナーゼ)遺伝子産物は,細胞の成長を制御すると共に,神経細胞増殖に役立つ事によって脳の発達における重要な役割を担っています。ALK遺伝がechinoderm microtubuleassociated protein-like 4 (EML4)などの他の遺伝子との融合を形成すると,結果的にEML4-ALKの遺伝的変異が非小細胞肺がん(NSCLC)の主要な発がん性ドライバーとなります。



EML4-ALK Fusion

ALK阻害物質に対するATCC® CCL-185IGTMの生存率
A, B:ATCC® CCL-185IGTMと親株のA549に各濃度のALK阻害物質crizotinibとceritinibを添加し,生細胞解析で細胞生存率を測定し,用量反応曲線を作成した。
C, D:ATCC® CCL-185IGTMと親株のA549に各1μMのcrizotinibとceritinibを添加し,生細胞解析で細胞生存率を測定した。

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RAS Mutant Isogenic Cell Lineの検証結果例

MEMO

Rat Sarcoma (RAS)とは


Rat Sarcoma (RAS)がん原遺伝子は,低分子量GTPaseスーパーファミリーに属するKRASとNRASなどのタンパク質をコードしています。RASタンパク質は,細胞の成長,分化および生存に順番に影響を与えるAKTとERKパスウェイの下流エフェクターを引き寄せ活性化します。RAS遺伝子の変異はメラノーマでよく見られ,BRAF阻害物質に対する非常に弱い反応の前兆になりえます。



KRAS Mutant

KRASゲノム編集済み細胞株の細胞生存率
KRASゲノム編集済み細胞株は,親株のA375細胞株よりもBRAF阻害物質への抵抗性を示す。A375とKRAS Mutant-A375ゲノム編集済み細胞株に,Dabrafenib(A図)またはVemurafenib(B図)のいずれかを各濃度で5日間添加した。生細胞解析で細胞生存率を測定し,用量反応曲線を作成した。

NRAS Mutant

NRASゲノム編集済み細胞株の細胞生存率
NRASゲノム編集済み細胞株は,親株のA375細胞株よりもBRAF阻害物質への抵抗性を示す。A375とNRAS Mutant-A375ゲノム編集済み細胞株に,Dabrafenib(A図)またはVemurafenib(B図)のいずれかを各濃度で3日間添加した。生細胞解析で細胞生存率を測定し,用量反応曲線を作成した。

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IDH1 / IDH2 Mutant Isogenic Cell Lineの検証結果例

MEMO

Isocitrate dehydrogenases 1 / 2 (IDH1 / IDH2)とは


Isocitrate dehydrogenases 1 / 2 (IDH1 / IDH2)遺伝子は,通常は代謝経路の脂肪酸合成またはTCA回路に関与しています。これらのタンパク質が変異した場合,ヒストンメチル化への関与により腫瘍形成を促進します。



IDH1 Mutant

IDH1-mutant-U-87 MGゲノム編集済み細胞株におけるがん代謝物発現の増加
IDH1変異細胞株の生物機能応答を解析するため,がん代謝物発現D-2-hydroxyglutarate (D-2HG)の蓄積と分泌をモニターした。播種7日後,親細胞U-87株とIDH1変異細胞株の細胞内と細胞外のD-2HG濃度を測定した。

IDH2 Mutant

IDH2特異的阻害物質によって抑制されるIDH2 Mutant-TF-1におけるD-2HG濃度
IDH2ゲノム編集済み細胞株の応答を決定するため,AGI-6780とAG-221で親細胞株とIDH2変異細胞株で検証した。親細胞株とIDH2変異細胞株をIDH2特異的阻害物質含有または不含培地で3日間培養した。薬剤処理7日後にD-2HG濃度をPico-Probe D-2HG assay kitで検出したところ,細胞外のD-2HG濃度において数倍減少していた。

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参考資料

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価格

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EML4-ALK Fusion-A549; CRISPR/Cas9 Modified Cell line; Human (Homo sapiens), Isogenic
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