細胞浸潤活性測定キット CytoSelect Cell Invasion Assay

基底膜またはウシコラーゲンⅠを膜上面にコートした孔径8μmのポリカーボネート膜装着チャンバーと24 wellまたは96 wellプレートを組み合わせることにより、線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞および腫瘍細胞の浸潤（侵襲）活性（Invasion）を測定するキットです。

※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。
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CytoSelect Cell Invasion AssayのFAQは、こちらをご覧下さい。

NIH3T3株（ネガティブコントロール）、HT-1080株（2 μM Cytochalasin D添加無および添加有）の細胞浸潤活性の比較各細胞株を300,000 cells/well播種し、24時間FBSに対して浸潤させた。（#CBA-110使用）

上図：浸潤膜底面の浸潤細胞を染色図
下図：抽出後にOD 560測定結果

NIH3T3株（ネガティブコントロール）とHT-1080株の細胞浸潤活性の比較

各細胞株を200,000 cells/well播種し、24時間FBSに対して浸潤させた。
左下：Collagen Invasion Chamber Plate, Fluorometric (#CBA-111-COL)使用
右下：Laminin Invasion Chamber Plate, Fluorometric (#CBA-111-FN)使用

ヒトHT-1080細胞の定量（#CBA-111-COL使用）

培養液中のHT-1080細胞を計数し、次いでLysis Buffer/Cyquant GR Dyeを用いて溶解、検出を行った。

＊キットにより内容が異なります。詳細なキット内容は、各製品ページにてご確認下さい。

Q-1.　初めてCell InvasionAssayのボイデンチャンバー（Boyden chamber）を用いる場合に、CytoSelect Cell Invasion Kit でより成功するためには、24 wellまたは96 wellフォーマットのどちらを使用したら良いですか？

A-1.　細胞浸潤研究の初期段階か、またはまだ条件の最適化を行っている場合は、24 wellフォーマットの使用をお勧めします。条件を最適化し、アッセイプロトコルに慣れたら、96 wellフォーマットに移行することができます。

Q-2.　コラーゲンが膜底面にコートされた製品#CBA-101-COLと膜上面にコートされた製品#CBA-111-COLの違いは何ですか？

A-2.　これらの製品は、それぞれ走触性と浸潤の異なるプロセスのためのアッセイです。4種類の細胞遊走アッセイを提供することにより、研究者は様々な定義でより多くの情報が得られます。製品#CBA-101-COLは走触性を測定するように設計されており、遊走する細胞に対し、固相化されている細胞外マトリックスタンパク質が化学誘引物質として作用します。製品#CBA-111-COLは細胞の浸潤を測定するように設計されており、細胞の遊走、細胞外マトリックスタンパク質の分解、タンパク質分解および隣接組織へ細胞の移動を含めた複雑なプロセスからなります。このアッセイでは、細胞は消化のためにMMPなどの活性型プロテアーゼを発現し、そしてコーティングを通して移動（つまり浸潤）することが必須となります。

Q-3.　浸潤性アッセイを使用している場合、細胞剥離液を用いたインキュベーション間に上部チャンバー内の非遊走細胞が下部チャンバーへの膜を通過しないことをどうやって保証できるのですか？

A-3.　孔を通した細胞の受動的な動きを防止するため、ボイデンチャンバーに使用されている膜孔径は細胞の直径より常により小さくなっています。細胞は、その先端を拡張して膜の孔を通過できるようにアクチン／ミオシンの細胞骨格構造を再配置しなければなりません。これに対し、細胞剥離溶液を用いた30分間のインキュベーションでは、細胞が細胞骨格再配置を行うには不十分です。

Q-4.　96 wellフォーマットの比色法の浸潤アッセイはありますか？

A-4.　比色法の細胞浸潤アッセイは、24 wellプレートフォーマットのみご提供しています。残念ながら、比色法は96 wellフォーマットで提供するには感度が十分にはありません。

Q-5.　基底膜、コラーゲン、ラミニンをどのように選択したら良いですか？

A-5.　ほとんどの細胞浸潤研究ではインサートに基底膜をコートしたものを使用しています。コラーゲンおよびラミニンゲルコートインサートはそれら特定のECMを媒介する浸潤についての研究用です。

Q-6.　なぜ無血清培地を上層に、そして10％血清を下層に使用するのですか？

A-6.　血清は多くのサイトカインや成長因子を含むので細胞遊走や浸潤アッセイに化学誘引物質としてよく用いられています。細胞を無血清培地に再懸濁することにより、チャンバー内の上層細胞と下層の10％血清の間に化学誘導物質の勾配が生じ、それが細胞のゲル層を通した浸潤を誘引します。

Q-7.　アッセイの実施前に、無血清培地中で細胞を培養する必要がありますか？

A-7.　飢餓は、必ずしもアッセイ前には必要ありません。血清は多くのサイトカインと成長因子を含み、飢餓細胞は化学誘引物質の処理に通常よく反応するため、研究者によっては細胞（通常、がん細胞株）を飢餓させる場合があります。

Q-8.　ECMのコンポーネントは？

A-8.　基底膜アッセイのインサートは、マトリゲルと同様のECMがコートされています。ECM抽出液は、マウスのEngelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcomaから調製されており、ラミニンを主成分として、コラーゲンⅣ、ヘパラン硫酸塩、プロテオグリカン、エンタクチンおよび他の成分を含んでいます。

Q-1.　比色法のキットと蛍光法のキットとどちらがより高感度ですか？

A-1.　蛍光アッセイは比色アッセイよりも高感度ですが、比色アッセイでは染色ステップ後と抽出前に目視で細胞数を測定することができます。目視による測定は、蛍光法を含めたどんなアッセイよりも高感度です。

Q-2.　比色法ではどのように染色を行いますか？

A-2.　比色法のCell Invasion Assayでは細胞の生死に関わらず細胞を固定・染色する染色液を使用しています。染色は水では洗浄されませんが、抽出液で容易に溶解することができます。抽出液は、その後ELISAリーダーで560 nmの吸光度を測定します。

Q-3.　浸潤アッセイプレートのウェルは取り外し可能のフォーマットですか？

A-3.　ECMチャンバープレートは12個の独立したインサートを含む24 wellプレートです。これらのインサートは取り外し可能で、未使用のインサートは4℃で必要な時点まで保存することができます。

Q-4.　他にポジティブコントロールとして使うことができる細胞がありますか？

A-4.　HT-1080細胞が入手不能の場合には、MDA-231細胞を用いることができます。

Q-5.　インサート上の非特異的な染色をどうやって除去できますか？

A-5.　インサートを染色後、非特異的な染色は綿棒で洗浄でき、それで最初に落ちなかった残存染色の確認が容易になります。綿棒を水で濡らし、ベンチに対して押し付けて平坦にします。これで綿棒がインサートの角にも接触できるようになります。抽出がすでに実行済みであれば、どんな浸潤細胞もインサートの底面に接着するので、インサートはまだ再染色することができます。染色の除去の問題が解決できない場合、細胞はいつでも目視により測定できます。

Q-6.　後の実験でインサートを再使用できますか？

A-6.　24 well浸潤アッセイではインサートは基底膜タンパク質でコートされていて、実験後は無傷ではないため再使用できません。キットは12個の独立したインサートで供給されており、未使用のインサートは4℃で必要な時まで保存することができます。

Q-7.　浸潤細胞が浸潤後にまばらな分布を示すのは正常ですか？

A-7.　それは正常で完璧な結果です。遊走アッセイでは、ほとんどの細胞が染色後に均一に分布します。浸潤アッセイではそれとは異なり、ECM層を細胞がECM層を貫通しなければなりません。いくらかの非常に活発な細胞が、このECM層を消化し他の細胞が通過できる孔を開けます。

Q-8.　浸潤後に血球計で細胞の生存率を測定できますか？

A-8.　細胞は細胞剥離工程および細胞剥離バッファー中でも生存しており、生存率の測定に使用できます。この工程でまだ細胞は生存していますが、浸潤細胞の低い細胞濃度と血球計の感度の低さのために測定は困難です。血球計の一つのセルで細胞を観察可能なのは、10,000細胞/ml相当です。たとえ最も侵攻性の細胞株でも遊走・浸潤アッセイでは、わずか5～10％の細胞しか遊走が期待できません。もし最大の300,000細胞をこのアッセイで使用し、その10％が遊走したとすれば、まだアッセイ当たり30,000細胞が得られます。

Q-9.　もし他の培地を要求する細胞の場合、それでも可能ですか？

A-9.　このアッセイの開始前に、無血清培地で細胞懸濁液を調製して下さい。この培地では細胞を培養する必要はありません。

Q-1.　96 well浸潤チャンバープレートは、一度の実験で使い切る必要はありますか？

A-1.　96ウェル浸潤アッセイは、一度にすべてを使用する必要があります。すべてのコートされたインサートはシングルプレートのため、すべてのウェルが使用されていない場合でも37℃インキュベーター内で浸潤アッセイの一晩のインキュベーションを行う必要があります。未使用のウェルに基底膜層は、湿潤環境で長時間のインキュベーション後に不安定になるため再使用することができません。96 well浸潤アッセイは、ハイスループットラボ用に特別に設計されています。一方で24 well浸潤アッセイは個別かつ取り外し可能なインサートを含んでおり、12アッセイ全てを一回で使い切る必要はありません。どの24 well滅菌済み細胞培養プレートでも、これら取り外し可能な浸潤ユニットに用いることができます。

Q-2.　培地にCaCl2、MgCl2およびBSAを追加する必要はありますか？

A-2.　浸潤アッセイのために血清中のBSAを添加する必要はありませんが、CaCl2とMgCl2は細胞接着の要因であるインテグリンレセプターの活性化に必要とされるので重要です。ほとんどの培地ではCaCl2とMgCl2を含んでいますが、これらを含まない培地を使用する場合には、補足する必要があります。