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トランスフェクション効率確認用のポジティブコントロールに レポーター遺伝子(GFP,LUC,mCherry,Tomato,β-Gal)をコードしたmRNA

掲載日情報:2021/07/14 現在Webページ番号:64375

3’末端にポリアデニル(poly A)tailを有する修飾mRNAです。一般的に使用されるレポータータンパク質(GFP,ルシフェラーゼ,mCherry,Tomato,β-Gal)を発現するラインナップがあります。
トランスフェクション効率確認用のポジティブコントロールとして有用です。

レポーター遺伝子をコードしたmRNA
修飾mRNAは哺乳動物系に最適化されており,高い安定性と非免疫源性によりレポータータンパク質を高発現します。

  • 5moU修飾 :ウリジンを5-methoxyuridineに置換することで自然免疫応答を低減します。
  • Cap 1 構造:mRNAを分解から保護します。
  • poly(A)tail:翻訳効率とmRNAの安定性を向上します。

ユーザーレビュー

mCherry coding mRNAを内包した人工ウイルスキャプシドの創製
鳥取大学 学術研究院工学系部門 教授 松浦 和則 様

 

OZ Biosciences社のmRNA製品群

ラインナップ 製品の概要 用途
Reporter gene mRNA
(本製品)
3’末端poly A修飾RNA トランスフェクション効率確認用
ポジティブコントロール
Genome editing mRNA Cas9またはCREの5’末端にpoly Aを有する,
安定性の高い非免疫原性の修飾RNA
CRISPR-Cas9タンパク質または
NLS融合CREリコンビナーゼ発現
Vaccine mRNA OVAのmRNBAの5’末端にpoly Aを有する
未就職または安定性の高い非免疫原性mRNA
アジュバント
Spike SARS-CoV-2 mRNA 3’末端にpoly Aを有し,SARS-CoV-2のE484K/N501Y
変異型スパイクタンパク質を発現する修飾mRNA
SARS-CoV-2スパイクタンパク質発現
ワクチン研究

メーカーカタログ(アプリケーションノート)

OZ Biosciences社のmRNA

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特長

  • 細胞質内で直接タンパク質を発現するため,核への取り込みは不要です。
  • DNAトランスフェクションよりタンパク質の発現が迅速です。
  • プラスミドDNA導入とは異なり,遺伝子挿入を引き起こしません。
  • タンパク質の発現はmRNAの量に直接相関します。
  • 一過性トランスフェクションで,タンパク質発現は限られた時間持続します。
  • プロモーター非依存的にタンパク質を発現します。
  • 分裂の遅い細胞や非分裂細胞に特に適しています。

トランスフェクション効率とタンパク質発現量の最適化のため,本製品のトランスフェクションにはRmesFectまたはRmesFect Stemのご利用をおすすめします。

mRNA contains a poly(A) tail at the 3’ end

3’末端にポリアデニル(poly A)tailを有する修飾mRNA



mRNAの発現様式の違い

成熟mRNA(左図)と5’poly(A)tailを有する修飾mRNA(右図)の発現様式の違い



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使用例

GFP mRNA(#MRNA11)を用いた各種細胞でのGFPの発現

GFP mRNA(#MRNA11)を導入した各種細胞でのGFPの発現



GFP mRNA/mCherry mRNAを用いた各種細胞での発現

GFP mRNAまたはmCherry mRNAを用いた各種細胞での発現
左図:RmesFectを用いてGFP mRNAを導入したHeLa細胞でのGFPの発現
右図:RmesFectを用いてmCherry mRNAを導入したSK6細胞でのmCherryの発現

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レポーター遺伝子

GFP mRNA

緑色蛍光修飾タンパク質を高発現するように設計されています。哺乳類細胞培養で一般的に使用される直接検出レポーターであり,励起488 nm/蛍光507 nmで発光する明るい緑色の蛍光を発します。

LUC mRNA

ホタルルシフェラーゼを高発現するように設計されています。哺乳類の細胞培養では,遺伝子発現と細胞生存率の両方を測定するために一般的に使用されます。基質であるルシフェリンの存在下で生物発光を発します。

mCherry mRNA

造礁サンゴDiscosoma sp.で見られるタンパク質であるDsRedに由来する蛍光タンパク質mCherryをコードします。mCherryは,励起587 nm/蛍光610 nmで発光する単量体フルオロフォアです。光安定性であり,光退色に耐性があります。

Tomato mRNA

オレンジ色の蛍光タンパク質をコードします。励起551~557 nm/蛍光579~583 nmで,蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡,蛍光活性化セルソーティング(FACS)で検出できます。

Tomato mRNAの発現

RmesFectを使用して Tomato mRNAをトランスフェクションしたHEK細胞

β-ガラクトシダーゼ(β-Gal)mRNA

細菌のLacZ遺伝子のタンパク質産物をコードします。β-Galはβ-ガラクトシドの単糖への変換を触媒します。トランスフェクション効率を評価するために使用される一般的なマーカー遺伝子です。


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ユーザーレビュー


mCherry coding mRNAを内包した人工ウイルスキャプシドの創製

松浦 和則 様
 鳥取大学 学術研究院工学系部門 教授

鳥取大学 学術研究院工学系部門

松浦研究室の集合写真(後列 右から2人目が松浦教授)

1. 背景

球状ウイルスは,タンパク質が正20面体対称となるように自己集合した「キャプシド」に核酸が内包された生体超分子である。球状ウイルスのキャプシドは,核酸が無くてもタンパク質だけで自己集合し,決まった大きさの内部空間を有するナノカプセルを形成することから,ドラッグデリバリーシステム(DDS)のキャリアや,ナノコンテナ・ナノリアクターとしても応用されている。当研究室では,化学的に分子設計可能なトマトブッシ―スタントウイルス由来のβ-Annulus ペプチド(INHVGGTGG AIMAPVAVTRQLVG)の自己集合により,天然の球状ウイルスキャプシドのような内部空間を有する粒径30~50 nmの「人工ウイルスキャプシド」を構築することに成功している1)。近年,新しいタイプの核酸医薬品としてmRNAが注目されており,タンパク質補充療法やワクチンとして使用できることが示されている。mRNA医薬はDNA医薬とは異なり,細胞質で直接タンパク質合成を誘導するという利点がある。しかし,一般的にmRNAはリボヌクレアーゼによる分解のため不安定であり,負電荷の多い細胞膜との静電反発により膜透過しにくい。そのため,mRNAを選択的に内包し,細胞内に送達するナノサイズのDDSキャリアの開発が望まれている。そこで我々の研究室では,上記のβ-Annulus ペプチドからなる人工ウイルスキャプシドにmRNAを内包する方法を開拓した。


2. mCherry cording mRNAの人工ウイルスキャプシドへの内包

天然のRNAウイルスは,キャプシド内部のRNA結合部位との相互作用を介して,選択的にRNAを内包している。人工ウイルスキャプシド内にmRNAを選択的に内包するために,我々は,真核生物のmRNAの3’末端側に100塩基程度のpoly A テールが付加されていることに着目し,dT20とmRNAのpoly A テールの二重鎖形成を介して人工ウイルスキャプシド内にmRNAを選択的に内包することを考えた2)。この戦略を効果的に実証するために,poly A テールを有し,細胞内導入を可視化できる蛍光性タンパク質をコードしているmRNA試薬を探していたところ,フナコシで販売しているmCherry cording mRNA(メーカー:OZ Biosciences社)に出会った。キャプシドの内側に配向するβ-Annulus ペプチドのN末端にCysを導入し,ジスルフィド結合を介してdT20を連結したdT20-SS-β-Annulus コンジュゲートを合成した。このdT20-SS-β-Annulusと未修飾β-Annulus ペプチドを共集合させる際に,mCherry cording mRNAと二重鎖形成させることで,粒径52 nmのmRNA内包人工ウイルスキャプシドを構築することができた(図A~C)。このmRNA内包人工ウイルスキャプシドは,十分なリボヌクレアーゼ耐性を示し,細胞透過性ペプチド(His16)修飾によりHepG2細胞内に導入され,mCherry の発現が共焦点レーザー蛍光顕微鏡で確認された(図D)。これらの結果は,人工ウイルスキャプシドがRNA医薬のデリバリー材料として応用可能であることを示唆しており,今後も種々検討したいと考えている。


3. 参考文献

1) K. Matsuura, Chem. Commun., 54, 8944 (2018).
2) Y. Nakamura, Y. Sato, H. Inaba, T. Iwasaki, K. Matsuura, Appl. Sci., 10, 8004 (2020).


mCherry coding mRNAを内包した人工ウイルスキャプシドの創製

(A) mRNA内包人工ウイルスキャプシドの構築,(B) DLS粒径分布,(C) TEM像,(D) HepG2細胞内でのmCherry cording mRNAの発現

本製品の使用文献
Y. Nakamura, Y. Sato, H. Inaba, T. Iwasaki, K. Matsuura
Encapsulation of mRNA into Artificial Viral Capsids via Hybridization of a β-Annulus-dT20 Conjugate and the Poly(A) Tail of mRNA
Applied Sciences,10, 8004 (2020).


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価格

修飾mRNA,コード遺伝子:GFP

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GFP mRNA, Modified(5moU)
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修飾mRNA,コード遺伝子:Tomato

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修飾mRNA,コード遺伝子:Beta-Gal(bacterial LacZ gene)

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非修飾mRNA,コード遺伝子:GFP

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非修飾mRNA,コード遺伝子:Beta-Gal(bacterial LacZ gene)

[在庫・価格 :2021年09月18日 00時14分現在]

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関連製品:RNA用トランスフェクション試薬

トランスフェクション効率とタンパク質発現量の最適化のため,本製品のトランスフェクションにはRmesFectまたはRmesFect Stemのご利用をおすすめします。

[在庫・価格 :2021年09月18日 00時14分現在]

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RMESFECT
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mRNAを迅速かつ高効率で細胞に導入することができるトランスフェクション試薬。多種類の細胞株および初代培養細胞に適用可能。
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ニュース2017年6月1日号 p.23

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RMESFECT
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RMESFECT
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mRNAを迅速かつ高効率で細胞に導入することができるトランスフェクション試薬。多種類の細胞株および初代培養細胞に適用可能。
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RMESFECT STEM
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幹細胞や初代培養細胞に高効率かつ低毒性でmRNAを導入できるトランスフェクション試薬。低毒性で複数のmRNAを導入可能のため,mRNAを用いたiPS細胞の作製に有用。
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幹細胞や初代培養細胞に高効率かつ低毒性でmRNAを導入できるトランスフェクション試薬。低毒性で複数のmRNAを導入可能のため,mRNAを用いたiPS細胞の作製に有用。
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法規制等
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幹細胞や初代培養細胞に高効率かつ低毒性でmRNAを導入できるトランスフェクション試薬。低毒性で複数のmRNAを導入可能のため,mRNAを用いたiPS細胞の作製に有用。
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[在庫・価格 :2021年09月18日 00時14分現在]

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RMESFECT

文献数:0

説明文 mRNAを迅速かつ高効率で細胞に導入することができるトランスフェクション試薬。多種類の細胞株および初代培養細胞に適用可能。
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RMESFECT

文献数:0

説明文 mRNAを迅速かつ高効率で細胞に導入することができるトランスフェクション試薬。多種類の細胞株および初代培養細胞に適用可能。
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RMESFECT

文献数:0

説明文 mRNAを迅速かつ高効率で細胞に導入することができるトランスフェクション試薬。多種類の細胞株および初代培養細胞に適用可能。
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RMESFECT STEM

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説明文 幹細胞や初代培養細胞に高効率かつ低毒性でmRNAを導入できるトランスフェクション試薬。低毒性で複数のmRNAを導入可能のため,mRNAを用いたiPS細胞の作製に有用。
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説明文 幹細胞や初代培養細胞に高効率かつ低毒性でmRNAを導入できるトランスフェクション試薬。低毒性で複数のmRNAを導入可能のため,mRNAを用いたiPS細胞の作製に有用。
別包装品 別包装品あり
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