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反応速度や測定範囲で選択できるHRP用発色基質 ELISA用TMB基質／反応停止液選択ガイド（SurModics社）

掲載日情報：2021/06/18 現在Webページ番号：5372

サーモディクス /
SurModics
[メーカー略称：XLC]

ELISA用TMB基質です。低バックグラウンドで、安定性が高く、高感度であることに加えて、アッセイの感度やダイナミックレンジに合わせて選択できます。Ready-to-useの便利な1液組成の溶液タイプは、冷蔵で長期間保存できます。粉末タイプは、粉末状態で適切に保管することにより半永久的な保存が可能です。いずれのタイプも、HRPとの反応後も室温で約1時間安定した発色を示します。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

ELISA用TMB基質測定イメージ ELISA用TMB基質製品外観
ELISA用TMB基質測定イメージ

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各種TMB基質の感度の比較

濃度の異なるHRPに、各種TMB基質を添加し、反応停止後に吸光度（450 nm）を測定した。他社のTMB基質と比較して、TMBSおよびTMBWが高感度であることがわかる。

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ELISA用TMB基質の選択ガイド

感度と検出限界の違い

「感度」という用語は、文献で様々な定義がなされており、イムノアッセイにおいて論争の的となっています。アッセイ開発者は、「最も感度の高い基質」を求めますが、実際に必要なのは検出限界の低い基質です。感度と検出限界を別々に定義することにより、それぞれがイムノアッセイの設計においてどのような影響を与えるかを明確に区別することができます。高感度のアッセイが必ずしも最小値の検出結果を得られるとは限りません。検出限界はシグナル測定の誤差によって定義され、感度は全体的なシグナルの大きさによって決定されます。アッセイに最適なTMB基質を選択する際に、両方の概念を考慮することが重要となります。

感度と検出限界の違い

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図1 感度と検出限界の違い

  • 検量線aは、標準偏差がより低く、検出限界が低い
  • 検量線bは、感度は高い（傾きが急）が、標準偏差が高く、検出限界では劣る

感度とは、単位濃度あたりのシグナルの変化（用量／反応曲線の傾き）です。イムノアッセイにおいて、特定濃度で大きなシグナルが得られる場合、バックグラウンドよりも低濃度を検出できる可能性があります。図1は、感度レベルが異なる2つのアッセイを示しています。検量線bは、検量線aよりも傾きが大きいため、感度が高くなります。全体のシグナルが検出の可能性に影響を及ぼすことがありますが、ここでは個々の測定エラーの重要性は無視しています。

検出限界とは、下限濃度であり測定試料が存在しないバックグラウンドシグナルとは統計的に異なるシグナルであり、標準偏差によって決定されます。エラーが少ないほど、低濃度とバックグラウンドとを区別することができます。多くの場合、高い感度が必要な際は、より低い検出限界が求められます。

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HRP-TMB検出システムの例

HRP-TMB検出システムの例

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図2 検出システムのイメージ

  • 青色：ウサギ抗マウスIgG抗体
  • 緑色：ビオチン（Btn）標識マウスIgG
  • Strep：ストレプトアビジン
  • HRP：セイヨウワサビペルオキシダーゼ


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HRPとTMB基質

イムノアッセイで広く用いられているのが、抗体、ハプテンおよびペプチドに簡単に結合できる、分子が小さく（40 kDa）安定性の高い酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）と発色基質TMBの組み合わせです。SurModics社は、反応速度の異なるTMB基質を提供しています（図3参照）。基質TMBXは、TMB基質製品ラインナップの中でも反応速度が遅い製品ではありますが、検出限界が低く、より幅広いダイナミックレンジを兼ね備えている長所を有しています。このことは、同一基質を使用してより広い範囲の濃度を測定できることを意味します。

感度と検出限界の違い

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図3 カイネティック反応曲線の比較

  • 測定試料：msIgG
  • 測定濃度：500 pg/ml
  • 測定波長：650 nm
感度と検出限界の違い1

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図4 TMBWとTMBXの検量線の比較

TMBXは、TMBWと比較してより広いダイナミックレンジを有することがわかる。

  • 測定試料：msIgG
  • 測定濃度：～10,000 pg/ml
  • 測定波長：450 nm
感度と検出限界の違い2

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図5 TMBWとTMBXの検出限界の比較

TMBXとTMBWの検出限界を比較するために、低濃度域の検量線を作製した。検出限界については、TMBXとTMBWは同等であることがわかる。

  • 測定試料：msIgG
  • 測定濃度：0～10 pg/ml
  • 測定波長：450 nm

SurModics社は、特性の異なる高品質のTMB基質のバリエーションと2種類の反応停止液、その他ブロッキング、安定化試薬、希釈液などアッセイ構築に必要な試薬をラインナップしており、研究者の皆様の多用なニーズにパーフェクトマッチをもたらします。

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イムノアッセイ構築における基質の選択ガイド

下図をクリックすると、「イムノアッセイ構築における基質の選択（Substrate Selection in Immunoassay Development）」についてより詳細な解説（英語）をご覧いただけます。

Substrate Selection in Immunoassay Development
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ELISA用TMB基質

特長

  • 様々な測定のニーズに合わせ、カイネティックモードの測定において幅広い反応速度の発色基質からご選択いただけます。
  • 他社のTMB基質と比較して、フェムトグラム当たりでより高いシグナルが得られます。
  • 組成の安定性が高いため、発色の持続性に優れています。
  • 製造時のロット間差がほとんどないため、再現性の高い結果が得られます。
  • ISO 13485:2016、およびISO 9001:2015の認証を受けています。

製品ラインナップ

品名をクリックすると製品の詳細、商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

相対反応速度*1 品名 略号 検出限界
（pg/ml）*1		 ダイナミックレンジ
（pg/ml）*1		 特長 包装／商品コード
100 ml 1 L
高 TMB High Definition TMBHD －*2 －*2 カイネティックモード測定においてクラス最高感度が得られるTMB基質 TMBHD-0100-01 TMBHD-1000-01
TMB Super Sensitive TMBS 2～4 2～320 高感度 TMBS-0100-01 TMBS-1000-01
標準 TMB TMBW 2～4 2～320 シリーズ中、最も汎用性が高い基質。ほとんどの定量、定性アッセイに適している。 TMBW-0100-01 TMBW-1000-01
TMB Conductivity TMBC －*2 －*2 感度はTMBWとほぼ同等だが、自動装置での測定に適している。 TMBC-0100-01 TMBC-1000-01
TMB Slow Kinetic TMSK 2～4 2～625 反応速度が遅いため、広いダイナミックレンジで使用できる。 TMSK-0100-01 TMSK-1000-01
TMB Super Slow TTMB 3～6 4～625 TMSKよりも反応速度が遅い。広いダイナミックレンジで使用できる。 TTMB-0100-01 TTMB-1000-01
TMB Extended Range One Component TMBX 2～4 2～2,500 検出限界は他のTMB基質と同等だが、より広いダイナミックレンジで使用できる。 TMBX-0100-01 TMBX-1000-01
低 TMB Double Slow TMDS －*2 －*2 反応速度がTTMBより遅い基質。 TMDS-0100-01 TMDS-1000-01

＊1 アッセイ条件により異なる可能性があります。
＊2 未計測
※ どのクラスのTMB基質を選択すべきか不明な場合、TMB（#TMBW）を最初にお試しいただくことをお勧めします。

使用例

カイネティックモードでの測定における反応速度の比較

各種TMB基質の感度の比較

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各種TMB基質の感度の比較
濃度の異なるHRPに、各種TMB基質を添加し、反応停止後に吸光度（450 nm）を測定した。アルカリフォスファターゼ（AP）のPNPS基質に比べて、HRPのTMB基質は高感度であり、またTMB基質の違いによっても感度に違いがあることがわかる。

各種TMB基質の反応速度の比較

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各種TMB基質の反応速度の比較
HRP（40 pg/ml）に各種TMB 基質を添加し、反応停止後に遮光状態で5分毎に吸光度（650 nm）を測定した。TMBSの吸光度が最も速やかに上昇することがわかる。

TMB（TMBW）のロット間差の検証

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TMB（TMBW）のロット間差の検証
ロットの異なるTMBWを発色基質として使用し、吸光度（650 nm）の経時変化を測定した。ロット間差がほとんどなく、安定した結果が得られることがわかる。

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反応停止液

TMB基質用の反応停止液です。停止後の測定波長が450 nm用と650 nm用があります。Ready-to-useの溶液タイプの製品（Liquid Stop Solution）と、蒸留水または脱イオン水を添加して調製する粉末タイプの製品（Stop Reagent）があります。

NSTP-450 nm Liquid Nova-Stop Solution

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450 nm Liquid Nova-Stop Solution（NSTP）

製品ラインナップ

商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

測定波長 発色 形態 使用方法 品名 特長 容量 商品コード
450 nm 黄色 溶液 Ready-to-use LSTP すぐに使用可能 100 ml LSTP-0100-01
1L LSTP-1000-01
BioFX Nova-Stop
（NSTP）		 独自の配合により、硫酸や塩酸に比べてシグナル安定性に優れ、反応停止後最大3時間まで測定が可能。 100 ml NSTP-0100-01
1L NSTP-1000-01
粉末 蒸留水または脱イオン水に溶解 STPR 粉末のまま長期保存が可能 100 ml STPR-0100-01
1L STPR-1000-01
650
（620～650）nm		 青色 溶液 Ready-to-use LBSP すぐに使用可能 100 ml LBSP-0100-01
1L LBSP-1000-01
粉末 蒸留水または脱イオン水に溶解 BSTP 粉末のまま長期保存が可能 100 ml BSTP-0100-01
1L BSTP-1000-01

使用例

反応停止液による検量線の違い

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反応停止液による検量線の違い

Blue Stop（650 nm）のは、Yellow Stop（450 nm）に比べて測定範囲（ダイナミックレンジ）がより広いことがわかる。

  • 検出試薬：TMB（TMBW）
  • 黄線：Yellow Stop（LSTP）
  • 青線：Blue Stop（LBSP）
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関連製品

写真をクリックすると拡大写真、品名をクリックすると製品の詳細または価格表をご覧いただけます。

品名 製品概要
StabilCoat/StabilGuard Immunoassay Stabilizerシリーズ

StabilCoat/StabilGuard Immunoassay Stabilizerシリーズ図をクリックすると拡大します（拡大図）

 ポリスチレンプレート、チューブ、ガラス、メンブレンまたはろ紙上の乾燥状態の抗体、抗原または酵素タンパク質の安定化およびブロッキング試薬です。タンパク質の活性を効果的に維持するとともに、非特異的結合を減少させます。
BSAを含むStabilCoatとBSA非含有のStabilGuardがあります。
StabilZyme Stabilizerシリーズ

StabilZyme Stabilizerシリーズ図をクリックすると拡大します（拡大図）

 HRPやアルカリホスファターゼ（AP）標識抗体やタンパク質を溶液中で長期間保存できる試薬です。HRP、AP酵素用の違いや、タンパク質を含有、非含有などによって、5種類の製品ラインナップがあります。
Assay Diluent（Protein-Free）

Assay Diluent（Protein-Free）図をクリックすると拡大します（拡大図）

 試料中に含まれるヒト抗マウス抗体（HAMA）やリウマチ因子（RF）などによるマトリックス干渉を抑えることを目的とした、試料希釈用の合成溶液です。タンパク質を含まないため、試料定量時に使用するBSAに起因する問題点を排除することができ、より正確な測定結果を得ることができます。
HAMAやリウマチ因子などの異好性抗体を含む試料に本製品を使用すると、S/N比が増加します。
ELISA Plate Coating Solution

Assay Diluent（Protein-Free）図をクリックすると拡大します（拡大図）

 抗原または抗体をマイクロプレートにコートする際に使用する溶液です。リン酸塩を配合した生理食塩水で、ほとんどのELISAシステムにおいて適応します。pHやイオン強度を最適化することにより、抗原または抗体を目的とする固相への特異的な結合を最大化します。
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ELISA用TMB基質

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TMSKよりも反応速度が遅い。広いダイナミックレンジで使用できる。組成：1液組成，特長：TMSKよりも反応速度が遅い。広いダイナミックレンジで使用できる。
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説明文 反応速度が遅いため，広いダイナミックレンジで使用できる。組成：1液組成，特長：反応速度が遅いため，広いダイナミックレンジで使用できる。
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TMB, HRP Microwell Substrate, Super Slow (1 Component Formulation)

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TMB, HRP Microwell Substrate (2 Component Formulation)

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TMB, HRP Microwell Substrate (2 Component Formulation)

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TMB, HRP Microwell Substrate, Powder

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  • 商品コード：TMBP-0005-01
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TMB, HRP Microwell Substrate, Powder

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  • 商品コード：TMBP-0010-01
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TMB, HRP Microwell Substrate, Powder

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  • 商品コード：TMBP-0025-01
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反応停止液

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450nm Liquid Stop Solution for TMB Microwell Substrate

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