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迅速、高効率なセルフリー、in vitro 無細胞タンパク質合成キット RTS 無細胞タンパク質合成キット

掲載日情報：2018/09/10 現在Webページ番号：4031

バイオテックラビット /
biotechrabbit GmbH
[メーカー略称：BRG]

E. coli、コムギ胚芽または昆虫細胞ライセートを用いる無細胞タンパク質合成キットです。迅速かつ高効率に無細胞タンパク質合成が行なえます。得られたタンパク質は特性研究、機能分析または構造解析に有用です。

※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

お知らせ

これまで5 PRIME社(メーカー略称：FPR)より販売しておりました無細胞系タンパク発現システム RTS （Rapid Translation System）は、2015年4月1日よりbiotechrabbit社(メーカー略称：BRG)が独占販売することになりました。商品コードの対応表は「RTS system（Rapid Translation System）に関するお知らせ」をご覧下さい。
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特長

  • E. coli、小麦胚芽または昆虫細胞ライセートにテンプレートと必要な試薬を混合してインキュベートするだけで、タンパク質が合成できます。
  • 透析膜を利用した画期的なシステム、CECF（Continuous Exchange Cell Free Protein Synthesis）Reaction Deviceを含むキットもあります。このシステムは、タンパク質合成の過程で副産物として生成するタンパク質合成阻害物質を、透析膜を介して除去することにより、効率的で長時間の反応が可能となり、タンパク質の収量が最大6 mg/mlまで向上します。
  • 機能性ジスルフィド結合形成タンパク質や細胞膜タンパク質合成専用キットも取り揃えています。
  • テンプレート DNA に 6×His タグ等のエピトープタグ配列を挿入することにより、ウエスタンブロッティングによる発現の確認や精製が可能です。

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無細胞タンパク質合成キットの製品ラインナップ

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タンパク質発現系・製品カテゴリ 品名 最大収量*
／反応液量		 使用可能な
テンプレート		 反応数 反応 商品コード
E. coli High Yield Kits
大腸菌細胞ライセートによるタンパク質大量発現用の基本システム		 RTS 100 E. coli HY Kit 20μg/50μl L、P 24 バッチ法 BR1400101
96 バッチ法 BR1400102
RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit 6 mg/1 ml P 5 CECF法 BR1400201
RTS 9000 E. coli HY Kit 50 mg/10 ml P 1 CECF法 BR1400301
E. coli Disulfide Kits
ジスルフィド結合含有タンパク質の可溶性向上と機能活性向上用のシステム		 RTS 100 E. coli Disulfide Kit 80μg/50μl P 24 CECF法 BR1400401
RTS 500 E. coli Disulfide Kit 2.5 mg/1 ml P 5 CECF法 BR1400501
Wheat Germ Kits
小麦胚芽タンパク質合成系を用い、真核生物由来cDNAの発現に適したシステム		 RTS 100 Wheat Germ CECF Kit 50μg/50μl L、P、R 24 CECF法 BR1401001
RTS 500 Wheat Germ CECF Kit 1 mg/1 ml L、P、R 5 CECF法 BR1401101
Insect Membrane Kits
昆虫細胞ライセートによる細胞膜タンパク質発現用システム。翻訳後修飾も期待される。		 RTS 100 Insect Membrane Kit 2μg/50μl L、P 5 バッチ法 BR1401501
20 バッチ法 BR1401502

L：直鎖状DNA、P：プラスミド、R：mRNA

＊テンプレートDNAの由来、配列等の影響により、タンパク質合成が表記の収量に満たない場合があります。

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無細胞タンパク質合成の反応原理

■RTSを用いたE. coli発現システム（例：RTS 100 E. coli HY Kit（#BR1400101））

RTSを用いたE. coli発現システム
  1. 目的遺伝子を有する発現プラスミドまたは直鎖状鋳型DNAをリアクションチャンバーに加える。
  2. in vitro 反応で、DNAはまずT7 RNAポリメラーゼによりテンプレートベクターからmRNAへ転写され、その後E. coli ライセート中に存在するリボソーム機構によって翻訳される。
  3. 4～24時間後にリアクションチャンバーに蓄積した発現タンパク質を回収する。

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CECF法とは

RTS システム（E. coli & Wheat Germ ライセート）では、一部の製品に、転写・翻訳のカップリング反応による大量のタンパク質合成を行うためにユニークなCECF法（Continuous Exchange Cell Free Protein Synthesis）法を採用しています。

CECF 法はタンパク質合成の過程で副産物として生成するタンパク質合成阻害物質を、透析膜を介して除去するシステムです。反応層と供給層を半透膜（10 kDa のポアサイズ）で仕切るディスポーザブルデバイスを用います。供給層に、反応の基質となる NTPs、アミノ酸、エネルギー源となる物質を大量に入れておくと、タンパク質合成反応の間、必要な分だけ半透膜を介して供給されます。それにより、タンパク質合成を高効率で安定的に長時間行う事が可能となっています。同時に、反応層において合成反応時に生じる老廃物等は半透膜を介して希釈されます。

■CECF 法の特長

  • 高効率タンパク質合成を長時間行なう事が可能となり、これまでの無細胞系と比較して、タンパク質合成量を飛躍的に向上させる事が可能です。
  • 同一反応溶液中で転写・翻訳反応のカップリング反応を可能にする事でDNAテンプレートを直接使用することが可能です。
CECFシステム用のReaction Deviceのイラスト

CECFシステム用のReaction Deviceのイメージ

■CECFシステムの例

通常、真核細胞のライセート中での転写反応と翻訳反応では、 最適な“Mg2+”濃度は大きく異なります。DNAテンプレートから効率良くタンパク質合成を行なうためには翻訳反応（低いMg2+ 濃度）の前に転写反応（高いMg2+ 濃度）を行い、別途mRNAの調製をする事が必要となります。E. coliライセートベースのシステム（例；RTS E. coli HYシステム）とは異なり、真核細胞ライセートをin vitroでの同一反応溶液中での転写・ 翻訳カップリング反応法に使用した場合、バッチ反応法で、相当量のタンパク質合成を行なう事はこれまでできませんでした。

RTS Wheat GermシステムはCECFフォーマットを使用することで、他のシステムとは異なり、透析により反応溶液中のMg2+濃度を高い濃度から低い濃度に変化させる事ができるため、結果として転写と翻訳のカップリング反応を、高い効率で行う事ができます。

（1）CECFのRTS E. coli 発現システムへの適用（RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit / RTS 9000 E. coli HY Kit）

CECFのRTS E. coli発現システムのイメージ
  1. 目的遺伝子を適当なベクターにクローニングし、リアクションチャンバーに添加する。
  2. in vitro 反応で、DNAはまずT7 RNAポリメラーゼによりテンプレートベクターからmRNAへ転写され、その後E. coli ライセート中に存在するリボソーム機構によって翻訳される。
  3. 透析膜を介してNTPsなどがリアクションチャンバーに供給される一方、タンパク質合成反応を阻害する副産物は反応チャンバーから除去される。
  4. 4～24時間後にリアクションチャンバーに蓄積した発現タンパク質を回収する。

（2）小麦胚芽CECFシステム（例：RTS 500 Wheat Germ CECF Kit(#BR1401001)）

小麦胚芽CECFシステム
  1. 　1a：反応装置内でDNAをテンプレートとして使用する場合、目的遺伝子は適当なT7駆動のpIVEX小麦胚芽発現ベクターにクローニングするか、または直鎖発現テンプレート作製のためのRTS Wheat Germ LinTempGen Setを使用したPCRによって5’と3’調節配列（UTRs）に融合する。
    　1b：反応装置内でmRNAをテンプレートとして使用する場合、in vitro 転写反応によって前もって別々に合成し、精製または未精製のままで翻訳反応に加える。
  2. 共役反応によりDNAはまずmRNAに転写され、次いでmRNAはタンパク質に翻訳される。
    　2a：T7 RNAポリメラーゼは、in vitro でDNAテンプレートを転写する。
    　2b：小麦胚芽ライセートの翻訳機構により、in vitro で合成されたmRNAを翻訳する。
  3. 製品は開始後最大24時間反応液中に蓄積する。

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使用例

■RTS 100 E. coli HY Kit(#BR1400101/#BR1400102)を用いた発現例

RTS 100 E. coli HY Kitの使用例

ETFをコードするDNAテンプレート（2step-PCRまたはpIVEX 2.3 expression plasmidへのクローニングによって生成したもの）、GFPをコードするベクター(pIVEX 2.3)をin vitro タンパク質合成反応に用いた。2step-PCRは、1回目のPCRは以下のプライマーセットを用いて実施し、次いでC末端His6-TagプライマーとRTS Linear Template Kit Plus（#BR1402401）を使用して2回目のPCRを行った。

Sense primer：5‘ GAAGGAGATAAACAATGGCTGAAATTACCGCATC 3‘

Antisense primer：5‘ TGGTGATGGTGGTGACCCCAAGACTGCTTGGACATCGCA 3‘

実験結果から、4時間の反応で、2-step PCRで最大400μg/ml、プラスミドテンプレートからは最大650μg/mlのタンパク質が得られた。

■RTS 100 Insect Membrane Kit (#BR1401501)を用いたタンパク質発現例

RTS 100 Insect Membrane Kitの使用例

6×His tag付プロテインキナーゼとカンナビノイドレセプター（CNR1）を、Penta-His HRPを用いて視覚化した。14C標識アミノ酸を用いて凝固因子とOGCP（mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier）を2回合成し、観察した。

※上に挙げたデータは、一部のキットの使用例です。その他、各製品の詳細については製品ラインナップから各製品のそれぞれの製品情報をご覧下さい。

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無細胞タンパク質合成キットの関連製品

製品カテゴリ 品名 包装 商品コード
タンパク質の可溶性を向上させるシャペロン RTS DnaK Supplement 5×RTS500用 BR1401601
RTS GroE Supplement 5×RTS500用 BR1401701
タンパク質のラベリング時に用いるアミノ酸のストック＊ RTS Amino Acid Sampler 1 set BR1401801
RTSシステム用に開発されたベクターと直鎖テンプレートのキット RTS Linear Template Kit Plus 20 reactions BR1402401
RTS Linear Template Fab Kit 96 reactions BR1402201
RTS 100 E. coli Lin Temp Gen Set, His-Tag 96 reactions BR1400801
RTS pIVEX E. coli His-tag, 2nd Gen. Vector Set 2 vectors
(10μg each)		 BR1400701
RTS Wheat Germ LinTempGen Set, His6-tag 96 reactions BR1401201
RTS pIX3.0 Vector 1 vector BR1402701
RTS pIX4.0 Insect Vector 1 vector BR1400901

※商品コードをクリックすると直接製品の価格表がご覧いただけます。
※ラベル化されたアミノ酸は含まれません。別途ご用意下さい。



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RTS 100 E. coli HY Kit (24reactions)

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（テクニカルサポート 試薬担当）

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タンパク質発現システム