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電気泳動(SDS-PAGE) - ウエスタンブロット(Western Blot)特集

掲載日情報:2020/11/04 現在Webページ番号:33381

タンパク質の電気泳動(SDS-PAGE)ゲル,サンプルバッファー,タンパク質分子量マーカー,電気泳動槽などをご紹介します。

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SDS-PAGE



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電気泳動(SDS-PAGE)の原理

ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Polyacrylamide Gel Electrophoresis:PAGE)は,タンパク質や核酸といった生物高分子を分離するために最も広く使用されている実験手法の一つです。
高分子は分子の長さ,構造,電荷により電気泳動移動度が異なります。一般的に高分子を電気泳動する際はネイティブか変性状態で行いますが,分子の長さで分離する場合は変性状態(還元SDS-PAGE)で泳動します。一方で,タンパク質の3次元的構造などの情報を得る目的の場合は,Native-PAGEまたは非還元SDS-PAGE(還元剤を用いない)が行われます。
タンパク質の場合は,2-ME(メルカプトエタノール)やDTT(ジチオスレイトール)などの還元剤と陰イオン界面活性剤SDS(Sodium Dodecyl Sulfate:ラウリル硫酸ナトリウム)が変性に使用されます。還元剤によりジスルフィド結合が切断された線形ポリペプチド鎖にSDSが結合し,負に荷電します。
SDSが結合したポリペプチド鎖は,鎖長に応じた負電荷を有するため,ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行うと,ゲルの網目状構造がふるいの役割を果たし,陽極へ向かう移動速度が異なります。大きい分子は遅く,小さな分子は速く移動するため,およその分子量に基づいて分離することができます。 こうした分離方法をSDS-PAGEと呼びます。ウエスタンブロッティングはSDS-PAGEと抗体による検出を組み合わせた手法で,様々な成分を含む生物試料などから特定のタンパク質を検出するために広く使用されます。
SDS-PAGE原理

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電気泳動(SDS-PAGE)プロトコル

SDS-PAGEプロトコル (クリックで展開します)
  1. 分離するタンパク質の分子量に応じて使用するポリアクリルアミドゲルの濃度を決める。
    ・例1:100~500 kDaのタンパク質の場合 4~8%濃度のゲル
    ・例2:10~200 kDaのタンパク質の場合  4~20%濃度のゲル
  2. ゲルを電気泳動装置にセットする。
  3. SDS-PAGE泳動バッファー(ランニングバッファー)を調製する。10×SDS-PAGE Running Buffer(RCK社:#MB-017)を使用する場合,10×バッファー 50 mlに脱イオン水450 mlを加えると1×バッファーが500ml作製できる。
  4. 電気泳動装置のチャンバーに泳動バッファーを入れる。
  5. 試料の調製
    ・ライセート(サンプルバッファーで調製済み)の場合:
    マイクロチューブに試料を適量移し,β-メルカプトエタノール(BME,2ME)を終濃度が0.55 Mになるように加える(例:ライセート試料 25μlに対し,BME 1μlを加える)。ピペッティングでよく混合する。
    ・その他のタンパク質試料の場合:
    マイクロチューブに試料と,同量の2×サンプルバッファー(RCK社:Sample Buffer #MB-018),0.55 M BMEを加える。試料のタンパク質濃度が充分高いことを確認しておく。タンパク質の種類や検出方法にもよるが,タンパク質終濃度で1~500μgが必要。
    ・分子量マーカーの準備:
    SDS-PAGEでは,未染色の分子量マーカーまたは染色済みのプレステイン分子量マーカーが使用される。PAGE後にウエスタンブロッティングを行う場合は, プレステイン分子量マーカーの使用を勧める。
    還元剤としてDTT(ジチオスレイトール)を使用する場合や,サンプルバッファーにあらかじめ還元剤が含まれる場合もあります。
  6. 試料を入れたマイクロチューブを95℃のヒートブロックまたはウォーターバスに入れ,5分間加熱する。
  7. 加熱後,3分間遠心分離を行い,試料中の破片を沈殿させる。
  8. 試料をゲルにアプライする。ゲルの左側のレーンから順に分子量マーカーおよび試料をアプライする。ゲルによるが,1レーン当たり5~35μlの試料をアプライする。タンパク質濃度が100~500 μg/mlの場合,1レーン当たり0.5~17.5 μgとなるようにする。
    ※注意:通常SDS-PAGE後のCBB(Coomassie Brilliant Blue)染色での検出限界は,精製タンパク質の場合 1μg,ライセート試料の場合 10μgとされている。
  9. 電気泳動装置の蓋を閉め,電極をパワーサプライに繋ぎ,定電圧 150 Vにセットして電源スイッチをONにする。
    ※注意:電源がONの間は電気泳動装置に触れない。タンクからバッファーが漏れてしまった場合も,必ず電源を切ってから対応する。
  10. 45~90分間電気泳動を行ったら,電源を切る。泳動装置やゲルの大きさによって泳動時間は異なる。サンプルバッファーに含まれる青色色素(BPB)のラインがゲルの下端まで進んだら直ちに電源を切って泳動を終了する。
  11. 電極を外し,泳動装置の蓋を開けてゲルホルダーを取り外す。ゲルプレートから慎重にゲルを外し,CBB染色など検出工程に進む。


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電気泳動(SDS-PAGE)製品ラインナップ