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System Biosciences, LLC
システムバイオサイエンス / System Biosciences, LLC
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[掲載日情報:2015/06/11 現在]

guide RNAによるゲノム編集ツール CRISPR-Cas9 システム <特集>

CRISPR-Cas9システムとは

MEMO

CRISPR-Cas9システムとは


CRISPR-Cas9 システムは,ゲノム中で任意の領域を切断できる遺伝子改変ツールです。切断したい標的塩基配列に相補的な配列を含むguide RNA(crRNA:tracrRNA) とDNA 切断酵素Cas9 タンパク質により,ゲノム上の任意の配列を切断します。標的配列のデザインの簡便さや実験手法の容易さから,本システムはZinc Finger NucleaseやTALE Nuclease と並び,注目されるゲノム編集技術です。

CRISPR-Cas9システムとは

切断したい標的塩基配列を含むguide RNA(crRNA:tracrRNA)とCas9 タンパク質により,ゲノム上の任意の配列を切断します。
crRNA: CRISPR RNA, tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA

遺伝子のノックアウト

CRISPR-Cas9 システムでのゲノムの切断後NHEJ による修復が起こり,塩基の置換や欠損が誘引され,これにより遺伝子のノックアウトができます。また,切断した部位に特定の配列をノックインしたい場合には,その目的配列を含むドナーベクターを一緒にトランスフェクションすると,相同組換え(HDR)によりその配列をノックインすることができます。

■配列のデザイン方法

標的配列は,末端に「GG」が配置されている領域を選択し,NGG の上流20 塩基で設計します。切断したい標的配列を含むgRNA およびその相補鎖をオリゴ合成等で作成していただきます。

標的領域                           5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG 3’
デザインする配列の例 5’TGTATGAGACCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’
        3’ACTCTGGTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA 5’

ラインナップにより,標的配列の両端に付加する配列は変わります。

ウェブ上で公開されているguide RNA 設計用のソフトウェア

CHOPCHOP
CRISPRdirect

■操作方法概略

切断したいDNA 配列に対する相補的な配列を含むguide RNA,およびその相補鎖を設計し,それらの断片をCRISPR ベクターにクローニングします。作製したCRISPR-Cas9 発現プラスミドを目的細胞へトランスフェクションすると,CRISPR-Cas9 システムにより標的領域が切断されます。

また,Cas9 のmRNA,guide RNA をそのまま細胞にトランスフェクションする方法では,ホスト内での免疫反応が生じにくく,速やかに標的配列の切断を起こすことができます。

MEMO

Cas9 Nickase(Cas9(D10))について


Cas9 の変異体D10A は,Nickase として機能することが報告されています* 1。Cas9(D10A)は,野生型Cas9 のようにDNA 二本鎖を切断せず,一本鎖のみを切断しニックを入れます。そのため相同組換えによるゲノム編集において,二本鎖切断により引き起こされるDNA 修復機構NHEJ(非相同末端再結合)が起こらず,望ましくない領域での遺伝子欠失・挿入やオフターゲット効果を抑制することができます* 2。また,最近では2種類のguide RNA を用いて2か所にニックを入れることで,二本鎖切断によるノックアウトで細胞株におけるオフターゲット効果を50 ~ 1,500 倍まで減少できた例が報告されています* 3

*1 Jinek, M., et al., Science, 17, 337(6096), 816 ~ 821 (2012).
*2 Cong, L., et al., Science, 15, 339(6121), 819 ~ 823 (2013).
*3 Ran, F. A., et al., Cell, 12, 154(6), 1380 ~ 1389 (2013).

>Cas9 Nickase(Cas9(D10))について

標的部位のセンス鎖に対するguide RNA 1 とアンチセンス鎖に対するguide RNA 2 を作製し,Cas9 (D10A) を用いて2か所でニックを入れ,オフターゲット効果を抑制する。



MEMO

Cas9 Double Mutant について


Cas9 のDouble Mutant (D10A, H840A) はヌクレアーゼ活性およびNickase 活性を有していませんが,guide RNA 標的配列への結合能を有しています。オフターゲット効果の少ない転写リプレッサーとして機能すると考えられており* 4,部位特異的な転写制御の研究への応用が期待されています。

*4 Qi LS., et al., Cell, 152 (5): 1173-83 (2013).

CRISPR-Cas9システム製品ラインナップ

All-in-one Vector System RNA System Lentiviral System
guide RNA とCas9 タンパク質を1 つのベクターから発現できます。細胞株でのゲノム編集に有用 ES 細胞やin vivo実験での使用に最適 Cas9 安定発現細胞株の構築などに有用
All-in-one Vector System RNA System Lentiviral System

■製品ラインナップ

■製品ラインナップ

■製品ラインナップ

Multiplex gRNA Cloning Kit HR Targeting Vector 各種受託サービス
直線化したgRNA ベクターまたはCas9 All-in-one ベクターに,複数のguide RNA をクローニングできるキット 相同組換えを利用したゲノム編集用ドナーベクター ゲノム編集関連の各種受託サービス

■製品ラインナップ

  • ノックアウト・修復用ドナーベクター
  • ノックイン用ドナーベクター
  • GFP・RFPタグ導入用ベクター

■受託サービスラインナップ

  • CRISPR-Cas9/guide RNA発現ベクター作製サービス
  • HRドナーベクター作製サービス
  • ゲノム編集済み細胞株作製サービス

■System Biosciences 社のCRISPR-Cas9 システムの比較

Cas9 の種類機能標的への効果標的効率HDR 効率オフターゲット効果
Cas9 SmartNucleaseNHEJ やHDR による高効率なゲノム編集DNA 二本鎖の切断
Single Cas9 SmartNickaseHDR によるゲノム修飾ニックの導入(1か所) 検出限界以下
Pairing of Cas9 SmartNickaseNHEJ やHDR による非常に正確かつ高効率なゲノム編集ニックの導入(2か所)
Cas9 NullNuclease (Double Mutant)遺伝子発現調節標的配列に結合するがDNA を切断しない

Cas9の検出

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