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Pin-pointTM塩基編集システム
二本鎖切断（DSB）を伴わないゲノム編集が可能です Pin-pointTM塩基編集システム
掲載日情報：2023/11/29 現在Webページ番号：71018
Pin-pointTM塩基編集システムは、ニッカーゼnCas9のDNAターゲティング能力とシチジンデアミナーゼのDNA編集活性を利用し、Pin-point化学合成sgRNAと組み合わせて使用することで、標的点突然変異を導入します。
※ Horizon｜Dharmacon製品をご注文いただくには、事前にユーザー登録が必要です。ご注文方法の詳細はこちらをご覧下さい。
※ Dharmacon製品（メーカー略称：DHA）につきまして、2023年4月1日より製品ご注文時にHandling Fee（手数料）を本体価格とは別にご請求させていただきます。詳細は「Handling Feeについてのご案内」をご確認下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。
追加しました。
Pin-point塩基編集システムを構成する3つのコンポーネント
- Pin-point nCas9 mRNA：DNAの一本鎖のみを切断または「ニッキング」するCas9からヌクレアーゼを欠損させた「ニッカ―ゼ」nCas9に、ウラシルグリコシラーゼ阻害タンパク質（UGI）を融合させたもの1。
- Pin-point Rat APOBEC mRNA：アプタマー結合タンパク質と融合したシチジンデアミナーゼ塩基編集酵素（Rat APOBEC）。シチジンデアミナーゼ酵素は、塩基対が編集ウィンドウ（プロトスペーサーのPAM遠位端の4から8位：下記概略図中で、デアミナーゼ（青）が結合している箇所）内にある場合、C-G塩基対をT-A塩基対に変換します2。
- Pin-point synthetic sgRNA：nCas9とアプタマー：デアミナーゼ融合体を特定のDNA標的部位に誘導するアプタマー性シングルガイドRNA（sgRNA）。
nCas9およびAPOBEC mRNAは、それぞれヒトにコドン最適化されており、5'および3'核局在化シグナル（NLS）を有しています。in vitroで転写後、CleanCap AGを用いてキャップ付加され、さらにポリアデニル化されています。これらのmRNAは導入した細胞中でタンパク質に翻訳された後、核に局在化します。
哺乳類細胞に3つの構成要素すべてを導入することで、標的部位のC-GからT-Aへの塩基変換が誘導されます。このシステムは、遺伝子ノックアウト（未成熟終止コドンの導入3、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位の破壊4）、または点突然変異の導入に使用できます。
Pin-point塩基編集システムの概略図
nCas9（薄い灰色）を利用することで、DNAの二本鎖切断が起こらず、DNA損傷応答経路を作動させません。Pin-point sgRNAにはアプタマー（緑）が含まれており、アプタマー結合タンパク質（オレンジ）を介してデアミナーゼ（青）をリクルートし、塩基編集を行います。
参考文献
- Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.″ Nature, 533(7603), 420(2016). PMID:27096365
- Collantes, J.C., et al., "Development and Characterization of a Modular CRISPR and RNA Aptamer Mediated Base Editing System.″ CRISPR J., 4(1), 58(2021). PMID:33616445
- Billon, P., et al., "CRISPR-Mediated Base Editing Enables Efficient Disruption of Eukaryotic Genes through Induction of STOP Codons.″ Mol. Cell, 67(6), 1068(2017). PMID:28890334
- Webber, B.R., et al., "Highly efficient multiplex human T cell engineering without double-strand breaks using Cas9 base editors.″ Nat. Commun., 10(1), 5222(2019). PMID:31745080
追加しました。
特長
- DNAの二本鎖切断を伴わないゲノム編集が可能です。
1. 意図しない突然変異のリスクが低いです。
2. 染色体の切断による細胞毒性を起こすリスクを低減できます。 - 高い編集効率を有します。
1. 塩基編集により終止コドンの導入し、スプライス部位の破壊により高い効率で遺伝子KOを誘導します。
（細胞の確率事象的なDNA修復機構による非相同末端結合のエラーと比較した場合）
2. SNP編集や一塩基置換を高い効率で実現します。
（ドナーDNAを用いた相同組換え法と比較した場合） - ガイドRNA（sgRNA）をカスタムオーダーできます。
1. 複数の遺伝子に対して異なる位置にある複数の塩基の編集が可能です。
2. 多様な変異体を作出することで、対象とする生物学的現象における標的遺伝子のアミノ酸レベルでの詳細な機能情報を得ることができます。
追加しました。
ワークフロー
追加しました。
アプリケーション例
- 遺伝子ノックアウトの作製／SNP改変
- 独自の同時ノックアウトとノックインの実証
- 複雑な細胞モデルのためのマルチプレックスなゲノム編集
- DNA損傷応答経路に感受性のある細胞の編集
- 遺伝子の機能的特性評価のための点変異生成
- RNAi、CRISPRi、従来のCRISPR-Cas9で行った実験に対する直交検証
追加しました。
使用例
初代ヒトT細胞におけるマルチプレックスな塩基編集
活性化T細胞に、Pin-point mRNAと3つの標的（CD52、PDCD1、TRAC）に対するPin-point化学合成sgRNA、またはnon-targetingコントロール（NTC #1）sgRNAをそれぞれエレクトロポレーションした。Mockエレクトロポレーション（EP）細胞をネガティブコントロールとして使用した。エレクトロポレーション後6～7日目に細胞を回収し、PCR産物のPin-point解析用プライマーを用いたサンガー配列決定データから塩基編集レベルを算出した。
T細胞ドナー：N=8、独立した実験数：5、テクニカルレプリケート：二～三重試験。
初代ヒトT細胞におけるマルチプレックスな塩基編集の表現型解析
Pin-point塩基編集プラットフォームは、初代T細胞を効率的に多重遺伝子ノックアウトする。活性化T細胞に、3つの標的（CD52、PDCD1、TRAC）に対するPin-point mRNAおよびPin-point化学合成sgRNAをエレクトロポレーションし、7日後にフローサイトメトリーで解析した。PD1の発現を誘導するために、T細胞は48時間前にPMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）とイオノマイシンの存在下で培養した。CD52とTCRa/bの発現は非刺激細胞を用いて分析した。図は、塩基編集した試料およびモックエレクトロポレーション（EP）試料の、生細胞における各マーカー陰性細胞の割合を示す。
T細胞ドナー：N=2、テクニカルレプリケート：二～三重試験。
初代ヒトT細胞におけるマルチプレックスな塩基編集のフローサイトメトリーよる解析
塩基編集した試料とコントロール試料のおける3種類のマーカーのプロット。各マーカーの陰性細胞のゲーティングは生細胞で行った。
塩基編集によるトリプルノックアウトの編集効率
試料中の3つのマーカー（CD52、PD1、TCRa/b）が同時に陰性である細胞の割合。Pin-point塩基編集mRNAで編集した試料、およびモックエレクトロポレーション（EP）コントロールで、追加濃縮を行わず、生細胞における割合として示した。PD1の発現を誘導するため、3つのマーカーを同時に定量できるように、分析前にT細胞をPMA（phorbol 12- myristate 13-acetate）とイオノマイシンの存在下で48時間培養した。
T細胞ドナー：N=2、テクニカルレプリケート：二～三重試験。
トリプルノックアウト塩基編集のフローサイトメトリーゲーティング戦略
トリプル陰性の細胞数は生細胞数で正規化し、その割合を示した。右端のゲートの細胞数は、3つのマーカーすべてが陰性細胞。
左図：生細胞でゲーティングされたCD52陰性集団
中図：CD52陰性集団でゲーティングされたTCRa/b陰性集団
右図：CD52とTCRa/b二重陰性集団でゲーティングされたPD1陰性集団
追加しました。
Pin-point mRNAおよびsgRNAの必要量
Pin-point mRNAの必要量
| 必要量 | ウェル／フォーマットサイズごとの反応数＊ | |||
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| HEK 293T細胞（96ウェルプレートで50,000細胞／ウェル） | T細胞（24ウェルプレートで250,000細胞／ウェル） | |||
| Pin-point nCas9 mRNA | Pin-point Rat APOBEC mRNA | Pin-point nCas9 mRNA | Pin-point Rat APOBEC mRNA | |
| 1 μg/well | 0.1 μg/well | 1.56 μg/well | 0.22 μg/well | |
| 20 μg | 20回 | 200回 | 12回 | 90回 |
| 100 μg | 100回 | 1,000回 | 1,000回 | 450回 |
| 500 μg | 500回 | 5,000回 | 5,000回 | 2,252回 |
Pin-point sgRNAの必要量
| 必要量 | ウェル／フォーマットサイズごとの反応数＊ | |
|---|---|---|
| HEK 293T細胞（96ウェルプレートで50,000細胞／ウェル） | T細胞（24ウェルプレートで250,000細胞／ウェル） | |
| 60 pmol/well | Singleplex 20 pmol/well または Multiplex (3 guides) at 20 pmol/well each | |
| 2 nmol | 33回 | 100回 |
| 5 nmol | 83回 | 200回 |
| 10 nmol | 166回 | 500回 |
＊ 最適な結果を得るためには、各試薬の正確な量を、実験セットアップ、細胞タイプ、細胞数、プレートフォーマットごとに最適化する必要があります。
追加しました。
ご注文方法
Horizon｜Dharmacon製品をご注文いただくには、事前にユーザー登録が必要です。
初めてご注文いただくお客様はユーザー登録・ご注文方法の詳細をこちらでご覧下さい。
ユーザー登録済みのお客様はID（メールアドレス）とパスワードで、Horizon Discovery社のWebサイトトップページでログインして、製品を検索・ご指定の上ご注文下さい。 ⇒ご注文方法の詳細はこちら！
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価格
Pin-point nCas9 mRNA
[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
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Pin-point nCas9 mRNA |
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Pin-point nCas9 mRNA |
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Pin-point nCas9 mRNA |
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[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
Pin-point nCas9 mRNA
文献数： 0
- 商品コード：PNP12579
- メーカー：DHA
- 包装：20μg
- 価格：¥62,800
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point nCas9 mRNA
文献数： 0
- 商品コード：PNP12577
- メーカー：DHA
- 包装：100μg
- 価格：¥251,800
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point nCas9 mRNA
文献数： 0
- 商品コード：PNP12581
- メーカー：DHA
- 包装：500μg
- 価格：¥755,800
- 在庫：無(未発注)
- 納期：ご照会下さい ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
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Pin-point Rat APOBEC mRNA
[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
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Pin-point Rat APOBEC mRNA |
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Pin-point Rat APOBEC mRNA |
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[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
Pin-point Rat APOBEC mRNA
文献数： 0
- 商品コード：PNP12580
- メーカー：DHA
- 包装：20μg
- 価格：¥62,800
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Rat APOBEC mRNA
文献数： 0
- 商品コード：PNP12578
- メーカー：DHA
- 包装：100μg
- 価格：¥251,800
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Rat APOBEC mRNA
文献数： 0
- 商品コード：PNP12582
- メーカー：DHA
- 包装：500μg
- 価格：¥755,800
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control
[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
| 詳細 | 商品名 |
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #1 |
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #1 |
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #1 |
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #2 |
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #2 |
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #2 |
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[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #1
文献数： 0
- 商品コード：PNP-001000-01-02
- メーカー：DHA
- 包装：2nmol
- 価格：¥58,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #1
文献数： 0
- 商品コード：PNP-001000-01-05
- メーカー：DHA
- 包装：5nmol
- 価格：¥121,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #1
文献数： 0
- 商品コード：PNP-001000-01-10
- メーカー：DHA
- 包装：10nmol
- 価格：¥184,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #2
文献数： 0
- 商品コード：PNP-001000-02-02
- メーカー：DHA
- 包装：2nmol
- 価格：¥58,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #2
文献数： 0
- 商品コード：PNP-001000-02-05
- メーカー：DHA
- 包装：5nmol
- 価格：¥121,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Synthetic sgRNA Non-targeting Control #2
文献数： 0
- 商品コード：PNP-001000-02-10
- メーカー：DHA
- 包装：10nmol
- 価格：¥184,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Synthetic sgRNA Control
[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
| 詳細 | 商品名 |
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文献数 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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Pin-point Human TRAC Synthetic sgRNA Control |
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Pin-point Human TRAC Synthetic sgRNA Control |
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Pin-point Human TRAC Synthetic sgRNA Control |
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Pin-point Human CD52 Synthetic sgRNA Control Kit |
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Pin-point Human CD52 Synthetic sgRNA Control Kit |
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Pin-point Human CD52 Synthetic sgRNA Control Kit |
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Pin-point Human PDCD1 Synthetic sgRNA Control Kit |
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Pin-point Human PDCD1 Synthetic sgRNA Control Kit |
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Pin-point Human PDCD1 Synthetic sgRNA Control Kit |
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[在庫・価格 ：2024年05月01日 15時55分現在]
Pin-point Human TRAC Synthetic sgRNA Control
文献数： 0
- 商品コード：PNP-002000-01-02
- メーカー：DHA
- 包装：2nmol
- 価格：¥58,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Human TRAC Synthetic sgRNA Control
文献数： 0
- 商品コード：PNP-002000-01-05
- メーカー：DHA
- 包装：5nmol
- 価格：¥121,600
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Pin-point Human TRAC Synthetic sgRNA Control
文献数： 0
- 商品コード：PNP-002000-01-10
- メーカー：DHA
- 包装：10nmol
- 価格：¥184,600
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Human CD52 Synthetic sgRNA Control Kit
文献数： 0
- 商品コード：PNPK-002200-01-02
- メーカー：DHA
- 包装：1kit
- 価格：¥62,800
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Human CD52 Synthetic sgRNA Control Kit
文献数： 0
- 商品コード：PNPK-002200-01-05
- メーカー：DHA
- 包装：1kit
- 価格：¥125,800
- 在庫：無(未発注)
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Pin-point Human CD52 Synthetic sgRNA Control Kit
文献数： 0
- 商品コード：PNPK-002200-01-10
- メーカー：DHA
- 包装：1kit
- 価格：¥188,800
- 在庫：無(未発注)
- 納期：ご照会下さい ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
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Pin-point Human PDCD1 Synthetic sgRNA Control Kit
文献数： 0
- 商品コード：PNPK-002300-01-02
- メーカー：DHA
- 包装：1kit
- 価格：¥62,800
- 在庫：無(未発注)
- 納期：ご照会下さい ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
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製品価格とは別にHandling fee（手数料）が発生いたします。。 |
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Dharmacon製品 Handling Fee（手数料）についてのご案内 |
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Pin-point Human PDCD1 Synthetic sgRNA Control Kit
文献数： 0
- 商品コード：PNPK-002300-01-05
- メーカー：DHA
- 包装：1kit
- 価格：¥125,800
- 在庫：無(未発注)
- 納期：ご照会下さい ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
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Pin-point Human PDCD1 Synthetic sgRNA Control Kit
文献数： 0
- 商品コード：PNPK-002300-01-10
- メーカー：DHA
- 包装：1kit
- 価格：¥188,800
- 在庫：無(未発注)
- 納期：ご照会下さい ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
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