ULTRARIPA®Kit アプリケーションデータ

ULTRARIPA®Kitを用いてさまざまな知見が得られています。下記に新しいアプリケーションデータをご紹介いたします。

（データご提供：東京大学 大学院薬学系研究科 衛生化学教室）

COS-1細胞をPBSで洗浄後，SDS buffer，1％ Triton X-100 buffer，ULTRARIPA®Kit A buffer およびULTRARIPA®Kit B bufferで溶解し，遠心分離（14,000 rpm, 5 min,4℃）にて可溶性画分と不溶性画分に分離した。 不溶性画分は同量のSDS-PAGE サンプルバッファーで変性溶解した。脂質ラフトマーカーのひとつであるFlotilin1の可溶化できた量をSDS-PAGE／ウエスタンブロットで評価した。 1％ Triton X-100やRIPA bufferでは大部分のFlotilin 1は不溶性膜画分に留まっているのに対して，ULTRARIPA®Kit B bufferではほぼ全量が溶解できていることがわかった。

各バッファーの組成：
・SDS buffer （2％SDS, 1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）
・ULTRARIPA®Kit A buffer (1％ NP-40 Alternative，0.1％ SDS，50 mM Tris-HCl (pH8.0)，150 mM NaCl，0.5％ Sodium Deoxycholate)
・ULTRARIPA®Kit B buffer (組成非公開)
・1％ Triton X-100 (1％ Triton X-100, 50 mM HEPES・Na (pH 7.2), 150 mM NaCl）

（データご提供：国立精神・神経医療研究センター　神経研究所　疾病研究第五部）

使用した試料：マウス由来初代培養DRG神経細胞（DIV13，～10⁶ cells/35 mm dish）
ターゲットタンパク質：Integrinβ1, Flotillin 1

プロトコル：

結果：
NGF刺激でFlotillinの変動が見られなかったのに対し，Integrinβ1はNGFによりRIPA不溶性画分に濃縮するのが観察された。

（本データは学習院大学理学部　高島明彦教授，住岡暁夫助教との共同研究のもと，取得したものです）

◆B-buffer直接添加による可溶化効率の検証

使用した試料：マウス脳組織（海馬＋大脳皮質）由来P2膜画分^＊

＊P2膜画分の回収プロトコルはこちら

使用バッファー条件：
SDS：2％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
1％ Triton：1％ TritonX-100, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
ULTRARIPA®Kit
A-buffer(RIPA)：1％ NP-40, 0.5％ deoxycholate, 0.1％ SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl
B-buffer：非開示

プロトコル

結果

検証したいずれの神経シナプス関連タンパク質においても，ULTRARIPA®Kit B-bufferは1％ TritonX-100やRIPAバッファー（A-buffer）に比べて高い可溶効率が認められた。

◆神経細胞膜由来RIPA不溶性画分のB-buffer可溶化効率の検証

使用した試料：マウス脳組織（海馬＋大脳皮質）由来P2膜画分

プロトコル：

結果

B-bufferは神経細胞膜のRIPA不溶性画分に含まれる大部分のタンパク質を可溶化することができていることがわかった。
また，NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットであるGluN1，GluN2Bを高効率に抽出できた。
一方で，PSD95は可溶化向上が見られたものの，B-bufferの不溶性画分に残っていることがわかった。

◆ULTRARIPA®Kit を用いた神経シナプスタンパク質複合体の解析

使用した試料：マウス脳組織（海馬＋大脳皮質）由来のP2膜画分
ターゲット：NMDA型グルタミン酸受容体 NMDAR (GluN1/GluN2B)
　　　　　　AMPA型グルタミン酸受容体 AMPAR (GluA1/GluA2)

プロトコル：

結果：

ULTRARIPA®Kit B-bufferを用いることで，NMDAR，AMPARともに免疫沈降で複合体を特異的に検出することができた。

＊ SYN (Synaptophysin)