ELISAがうまくかない時のヒント集 ELISAトラブルシューティングガイド（R&D Systems）

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トラブル別インデックス

1. ☞ バックグラウンドが高い
2. ☞ シグナルが得られない
3. ☞ プレートすべてのウェルで吸光度が高い。
4. ☞ 標準曲線のOD値が全体的に低い（標準曲線の傾きが低い）
5. ☞ 測定にバラつきが見られる
6. ☞ 測定の再現性が低い
7. ☞ 検量線は作成できているが、測定物質を含む試料のシグナルが得られない
8. ☞ 検量線は作成できているが、試料の吸光度が高すぎる
9. ☞ プレートのウェル全体で吸光度が低い
10. ☞ Streptavidin-HRPを使用した際において、反応停止液を加えると緑色になる
11. ☞ エッジ効果（プレートウェルの位置による測定値の変動が見られる）
12. ☞ 測定結果に誤差・変動が生じる

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トラブルシューティング

1. バックグラウンドが高い

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. ウェルの洗浄が不十分	キットのプロトコルに従い、プレートを適切に洗浄して下さい。 洗浄バッファーを加えた後、30秒置いてからバッファーを捨てて下さい。 洗浄回数を数回増やして下さい。

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2. シグナルが得られない

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. 試薬の調製が誤っている	調製方法が正しいか確認して下さい。
	B. 試薬を誤った順序で添加している	各ステップで用いている試薬が正しいか、もう一度確認して下さい。
	C. HRP標識試薬が汚染されている	試薬を再度調製して下さい。
	D. スタンダードの不良（スタンダードのみシグナルが得られない）	スタンダードの調製方法を再度確認して下さい。 新しい試薬を使用して下さい。
	E. バッファーが汚染されている	試薬を再度調製して下さい。
ELISA構築用 キット	F. 抗体の濃度が十分ではない	抗体の濃度を濃くして下さい。
	G. 抗体の再構成にFCS（ウシ胎児血清）を含むバッファーを使用している	使用するバッファーを再検討して下さい。
	H. 捕捉抗体がプレートに十分コートされていない	ELISA用プレートを使用して下さい（細胞培養用プレートは使用しないで下さい）。 タンパク質を含まないPBSで捕捉用抗体を希釈して下さい。

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3. プレートすべてのウェルで吸光度が高い

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. ウェルの洗浄が不十分で、余分な試薬が残っている	キットのプロトコルに従い、プレートを適切に洗浄して下さい。 洗浄バッファーを加えた後、30秒置いてからバッファーを捨てて下さい。 洗浄回数を数回増やして下さい。
	B. 基質を調製するタイミングが早すぎる	調製した基質はプロトコルの指定時間以内に使用して下さい。
	C. プレートシールやリザーバーを使いまわしている	プレートシールやリザーバーはステップごとに新しいものを使用して下さい。
	D. バッファーが汚染されている	試薬を再度調製して下さい。
ELISA構築用 キット	E. Streptavidin-HRPの濃度が濃すぎる	Streptavidin-HRP溶液が正確に希釈されているか確認して下さい。必要に応じてStreptavidin-HRPの濃度を調節して下さい。

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4. 標準曲線のOD値が全体的に低い（標準曲線の傾きが低い）

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. 基質の反応時間が不十分	基質のインキュベート時間を延長して下さい。 キットに含まれる基質を使用して下さい。
	B. 操作法が不適切	キットのプロトコルをご確認いただき、再度実験を行って下さい。
	C. スタンダードの希釈系列が誤っている	プロトコル記載の計算方法を用いて下さい（他の方法では正確な標準曲線が得られない場合があります）。
ELISA構築用 キット	D. Streptavidin-HRP濃度が低すぎる	Streptavidin-HRP溶液が正確に希釈されているか確認して下さい。必要に応じてStreptavidin-HRPの濃度を調節して下さい。
	E. 捕捉抗体がプレートに十分コートされていない	ELISA用プレートを使用して下さい（細胞培養用プレートは使用しないで下さい）。 タンパク質を含まないPBSで捕捉用抗体を希釈して下さい。
	F. 検出抗体の濃度が低すぎる	検出抗体が正確に希釈されているか確認して下さい。必要に応じて検出抗体の濃度を調節して下さい。

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5. 測定にバラつきが見られる

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. ウェルの洗浄が不十分	キットのプロトコルに従い、プレートを適切に洗浄して下さい。 洗浄バッファーを加えた後、30秒置いてからバッファーを捨てて下さい。 洗浄回数を数回増やして下さい。 最後は洗浄バッファーを完全に取り除いて下さい。 プレートウォッシャーを使用している場合： 洗浄ポートに汚れやつまりがないか確認して下さい。 洗浄バッファーを加えた後、30 秒間保持する行程をプログラムに追加して下さい。 洗浄行程の途中でプレートの向きを180°回転させて下さい。
	B. プレートシールを使いまわしている	プレートシールは各ステップで新しいものを使用して下さい。
	C. プレートシールを使用していない	インキュベート時はプレートシールを使用して下さい。
	D. バッファーが汚染されている	試薬を再度調製して下さい。
ELISA構築用 キット	E. 操作法が不適切もしくはプレートへの抗体のコーティングが不均一	タンパク質を含まないPBSで捕捉用抗体を希釈して下さい。 捕捉抗体やブロッキングバッファーの液量やインキュベート時間などを再度ご確認下さい。 ELISA用プレートを使用して下さい（細胞培養用プレートは使用しないで下さい）。

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6. 測定の再現性が低い

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. ウェルの洗浄が不十分	キットのプロトコルに従い、プレートを適切に洗浄して下さい。 洗浄バッファーを加えた後、30秒置いてからバッファーを捨てて下さい。 洗浄回数を数回増やして下さい。 プレートウォッシャーを使用している場合： 洗浄ポートに汚れやつまりがないか確認して下さい。
	B. インキュベート時の温度条件がばらついている	推奨反応温度を守って下さい。 空調の影響があるなど、温度変化が激しい場所ではインキュベートを行わないで下さい。
	C. 測定ごとにプロトコルを改変している	測定間でプロトコルの改変を行わないで下さい。
	D. プレートシールを使いまわしている	プレートシールは各ステップで新しいものを使用して下さい。
	E. スタンダードの希釈系列が誤っている	プロトコル記載の計算方法を用いて下さい（他の方法では正確な標準曲線が得られない場合があります）。 内部コントロールを用意して測定して下さい。
	F. バッファーが汚染されている	試薬を再度調製して下さい。

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7. 検量線は作成できるが、測定物質を含む試料のシグナルが得られない

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. 試料中に測定物質が存在しない	内部コントロールを用意して測定して下さい。 再測定の検討と操作を再確認して下さい。
	B. 試料中に測定を阻害する物質が存在する	適切な試料希釈液を用いて、試料を希釈して下さい（最低でも2倍希釈）。可能であれば数段階の試料希釈列を作製し、測定を行って下さい。

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8. 検量線は問題なく作成できるが、試料の吸光度が高すぎる

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. 試料中に測定範囲を超える測定物質が含まれている	試料をさらに希釈して、再度測定を行って下さい。

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9. プレートのウェル全体で吸光度が低い

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. プレートリーダーの測定波長が誤って設定されている	プレートリーダーの測定波長を正しく設定して下さい。
	B. 基質添加後の発色反応が不十分	基質との反応時間を延長して下さい。
ELISA構築用 キット	C. プレートにコートされた抗体が劣化している	新たに捕捉用抗体をコートしたプレートを作製して下さい。
	D. 捕捉用抗体がプレートに十分コートされていない	ELISA用プレートを使用して下さい（細胞培養用プレートは使用しないで下さい）。 タンパク質を含まないPBSで捕捉用抗体を希釈して下さい。
	E. 抗体の再構成にFCS（ウシ胎児血清）を含むバッファーを使用している	使用するバッファーを再検討して下さい。

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10. Streptavidin-HRPを使用した際において、反応停止液を加えると緑色になる

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. 反応停止液を加えた後の混合が不十分	反応停止液をウェルに加えた後、黄色になるまで十分に混合して下さい。

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11. エッジ効果（プレートウェルの位置による測定値の変動）が見られる

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. 反応中の温度がウェルの位置によってが異なる（均一でない）	温度変化が激しい場所ではインキュベートを行わないで下さい。 プレートシールを使用して下さい。

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12. 測定結果に誤差・変動が生じる

ELISAキットの種別	考えられる原因	解決方法
ELISAキット／ELISA構築用 キット共通	A. アッセイの準備を断続的に行っている	使用する試薬類はすべてアッセイを開始する前に準備して下さい。
	B. 試薬の温度が室温になっていない	プロトコル中で特に指示のない場合は、使用前にすべての試薬が室温状態にあるかを確認して下さい。

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