溶菌・核酸抽出バイアスを防ぐために 前処理条件がマイクロバイオーム解析に与える影響

マイクロバイオーム解析では、シークエンスデータから微生物叢の構成を推定します。しかし、その結果は「試料中に実際に存在していた微生物」をそのまま反映しているとは限りません。
解析で検出されるのは、あくまで溶菌され、DNAまたはRNAが回収できた微生物です。特に、細胞膜が比較的壊れやすいグラム陰性菌は検出されやすい一方で、厚いペプチドグリカン層を持つグラム陽性菌や、強固な細胞壁を持つ真菌などは、溶菌が不十分な場合に過小評価される可能性があります。
このような偏りはランダムな誤差ではなく、特定の微生物群を系統的に見落とす溶菌・抽出バイアスとして問題になります。単なるノイズの増加ではなく、微生物叢プロファイル全体を一定の方向に歪め、主要な分類群の存在比や微生物叢全体の解釈に影響を与える可能性があります。

加熱処理などによって微生物を死滅させても、細胞壁や細胞構造が残ったままでは、核酸が抽出バッファー中に放出されないことがあります。核酸抽出では、DNAやRNAが溶液中に露出し、カラムやビーズなどの担体に結合できる状態であることが重要です。
例えば、壊れやすい微生物と壊れにくい微生物が同じ比率で存在していても、前者だけが効率よく溶菌されると、シークエンス結果では前者が実際より多く見えてしまいます。つまり、溶菌条件が不十分な場合、解析結果は試料中の真の存在比ではなく、抽出しやすかった微生物の比率を反映してしまう可能性があります。

溶菌条件が適切であっても、試料中に含まれる微生物以外の成分が、核酸抽出や下流解析を妨げることがあります。糞便、土壌、排水、植物組織、臨床スワブなどでは、それぞれ異なる阻害物質や夾雑成分への対策が必要です。

これらの阻害物質は、PCRやライブラリー調製の効率を低下させ、場合によっては解析の失敗につながります。阻害物質除去カラム、磁気ビーズ精製、キレート処理など阻害物質に応じた対策、既知量の標準物質を添加して回収率を確認するスパイクインコントロールなどを組み合わせることで、溶菌不良と阻害物質の影響を切り分けやすくなります。

溶菌・抽出バイアスを把握するには、組成が既知の微生物標準品を用いた評価が有効です。既知比率の微生物コミュニティを処理し、得られた解析結果と期待値を比較することで、どの微生物群が過小評価されているかを確認できます。
また、菌体標準品とゲノムDNA標準品を比較することで、バイアスが溶菌段階で生じているのか、抽出・精製以降の工程で生じているのかを推定できます。標準品を定期的に測定することにより、装置やプロトコルの性能変動も確認できます。スパイクインコントロールを用いることで、絶対定量に応用できる場合もあります。

マイクロバイオーム解析では、シークエンス技術やバイオインフォマティクスだけでなく、試料前処理の段階が結果の信頼性を大きく左右します。溶菌しやすい微生物だけを見て結論を出さないためには、試料の種類に適した溶菌条件、阻害物質除去、標準品による工程管理を組み合わせることが重要です。
特に、多様な微生物を含む試料や未知の微生物群を対象とする場合には、幅広い分類群に対応できる溶菌法を選択し、標準品を用いて溶菌・抽出バイアスを確認することが、より正確で再現性の高い解析につながります。