技術情報：タンパク質精製のフォーマット選び（アフィニティクロマトグラフィー）Vol.2

タンパク質の精製およびビオチンのブロッキングについてご紹介します。

※ 技術情報：タンパク質精製のフォーマット選び（アフィニティクロマトグラフィー）Vol.1はこちらをご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

複雑なタンパク質混合物の中から目的タンパク質を単離することは、他の分子の影響を受けずに機能解析を行うための前提条件であり、タンパク質精製はバイオテクノロジーにおける重要なアプリケーションの1つです。目的タンパク質は、別の分子に対する親和性（アフィニティ）という固有の性質を利用することで、他の分子から非常に効率的に単離できます。また、分子量や電荷、疎水性の違いなど、アフィニティ以外の特性を利用した精製も可能ですが、これらの特性はタンパク質間で大きく似通っている場合があります。

高い特異性と得られる目的タンパク質の純度の高さから、アフィニティを利用したシステムはタンパク質精製の主要方法となりました。しかし、His-tagなどの幅広く用いられているアフィニティタグの中には、欠点や制限を有するものもあります。これらのタグを用いると、目的タンパク質の性質に影響を与えたり、溶出や洗浄に厳しい条件が必要となって、目的タンパク質の収量に影響する可能性があります。さらに、多くのタグはさまざまなバッファー条件には対応できないため、精製後の実験に支障をきたさないように、目的タンパク質からタグを除去する必要があります。

幅広く用いられているStrep-tag技術は、2つのストレプトアビジン変異体（Strep-TactinおよびStrep-Tactin XT）と、2つのアフィニティタグ（Strep-tagⅡおよびTwin-Strep-tag）で構成されています。使用できるバッファー条件の制限が少なく、高い特異性により非常に高純度のタンパク質を得ることができます。

IBA社では、Strep-TactinまたはStrep-Tactin XTを用いたさまざまレジンを用意しており、Strep-tagⅡやTwin-Strep-tagとの融合タンパク質の精製に対応しています。Strep-TactinとStrep-Tactin XTではプロトコルが異なりますが、いずれのレジンも簡単かつ短時間に多様な方法で、高純度のタンパク質を得るという目的は共通しています。

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IBA社独自のStrep-tag技術は、組換えタンパク質のアフィニティ精製に広く利用されており、自然界で最も強力な非共有結合性相互作用の一つであるビオチンとストレプトアビジンの相互作用に基づいて開発されています。このシステムには、2種類のアフィニティタグ（Strep-tagⅡおよびTwin-Strep-tag（Strep-tagⅡを連結したタグ））が含まれています。これらのタグのペプチド配列は、特別に設計されたストレプトアビジンの変異体であるStrep-TactinとStrep-Tactin XTに対して固有の親和性を示します。

Strep-tag技術は、生理学的条件下で非常に高純度のタンパク質が得られることを特長としており、タンパク質精製分野に加えて、アッセイ法開発のためのタンパク質の固相化、タンパク質間相互作用の研究など、さまざまなアプリケーションに利用できます。

細胞培養上清には、高濃度の遊離ビオチンが含まれている場合があります。Strep-Tactin XTをレジンとして用いる場合は、ビオチンはこのレジンに非可逆的には結合せず、結合能にも影響しないため、通常は大きな問題になりません。しかし、Strep-Tactinをレジンとして用いるアプリケーションでは問題となる場合があります。Strep-Tactinの機能低下を防ぐためには、アビジンを含む試薬BioLock（#2-0205-050）を用いて、遊離ビオチンを捕捉することができます。
アビジンは、ストレプトアビジンに非常によく似たタンパク質で、鳥類や爬虫類、両生類の卵白に存在します。アビジンは4つのサブユニットから構成され、1分子あたり最大4分子のビオチンと結合できます。ストレプトアビジンの変異体であるStrep-TactinおよびStrep-Tactin XTとは異なり、アビジンはStrep-tagⅡまたはTwin-Strep-tagとは結合できません。そのため、細胞ライセートや細胞培養上清に含まれる遊離ビオチンを選択的に捕捉することができます。一方で、目的タンパク質に付加されたStrep-tagⅡまたはTwin-Strep-tagはレジンに結合ができる状態のまま残ります。ビオチンを含む培地や細胞内のビオチンプールに関する概要は、下記Blocking of Biotin in Cell Lysates and Culture Mediaをご覧下さい。BioLockによるビオチンのブロッキングは簡単かつ迅速で、試料にBioLockを添加して、短時間インキュベートするだけで、前処理が可能です。

細胞ライセートには、遊離ビオチンに加えて少量のビオチン化タンパク質が含まれています。通常、細胞ライセート中のビオチン化タンパク質は量が少ないため、Strep-TactinまたはStrep-Tactin XTを用いたタンパク質精製の結果に影響しません。しかし、高感度が要求される分析に用いる場合は、この不純物を除去する必要があります。その選択肢の一つとして、タンパク質精製前に試料をBioLock（#2-0205-050）で処理する方法があります。また、目的タンパク質が既に精製済みで、Strep-Tactin Conjugate（#2-1502-001）やStrep-Tactin XT Conjugate（#2-1568-050）を用いてウエスタンブロッティングで検出したい場合には、アビジンによるブロッキングも可能です。検出直前に、アビジンを溶解したPBSでメンブレンを数分間インキュベーションします。ただし、検出にStrepMAG-Classicなどの抗体を用いる場合、ビオチン化タンパク質のブロッキングは必要ありません。Strep-TactinやStrep-Tactin XTとは異なり、この抗体はビオチンやビオチン化タンパク質を認識しないため、非特異的なシグナルは生じません。