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超解像顕微鏡観察時のスケール校正に! SpheroRuler - Calibration beads for SMLM microscopy

掲載日情報:2024/12/05 現在Webページ番号:72265

SpheroRulerは、遠赤色または緑色の蛍光色素でコーティングされたポリマー粒子の単分散懸濁液です。単分子局在顕微鏡法(Single-Molecule Localization Microscopy、SMLM)などの超解像顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察、走査型電子顕微鏡観察におけるサイズの基準として利用できます。粒子間でサイズや形状のばらつきが無く、x-y-z測定、三次元再構成法、または画質の評価を行う際の非常に実用的で信頼性の高い基準となります。生物試料と併せて使用できるため、観察時のものさし、ドリフト補正、位置ガイドとして用いることもできます。

Idylle社のメーカー紹介については、革新的な技術をいち早く製品化(Idylle社)をご覧下さい。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

単一SpheroRulerビーズのさまざまな顕微鏡観察手法による撮影像

単一SpheroRulerビーズのさまざまな顕微鏡観察手法による撮影画像



特長

  • 粒子サイズが均一で、ばらつきがほどんどありません。
  • 安定した明滅(Blinking)を示します。
  • 球形のため、どの方向からでも同じように観察できます。
  • 生物試料と混合して用いることができます。
  • 目的に応じて粒子サイズ、蛍光色素を選択可能です。

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製品ラインナップ

粒子径と蛍光色素は下記からお選びいただけます。
製品にはSpheroRuler懸濁液(PBS pH 7.4)50 μlが含まれます。
35 mmガラスボトムディッシュで推奨量 5 μlを使用した場合、10回の実験が可能です。

粒子径蛍光励起/蛍光波長濃度商品コード
100 nm650 nm/671 nm7×1011粒子/mlAFA-NAN-100-647
1 μm650 nm/671 nm7×108 粒子/mlAFA-NAN-1000-647
1 μm494 nm/514 nm7×108 粒子/mlAFA-NAN-1000-488
1 μm650 nm/671 nm、494 nm/514 nm7×108 粒子/mlAFA-NAN-1000-647+488
6 μm650 nm/671 nm3.5×106粒子/mlAFA-NAN-6000-647
画像内容説明


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操作方法概略

  1. 1~2分間超音波処理を行い、その後ボルテックスを用いて懸濁する。
  2. 5 μl分取し、ディッシュに添加する。
  3. イメージング用バッファーを添加し、封入する。
  4. 10~15分間静置し、ビーズを沈殿させてから観察に用いる。

関連製品

繰り返し観察可能な超解像イメージング用バッファーEversparkも取り扱いがあります。
Eversparkの詳細はこちらをご覧下さい。

Eversparkの製品画像


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使用例

SRRF-Stream顕微鏡によって再構成したSpheroRulerビーズ画像

画像内容説明

(A)広視野顕微鏡で撮影したSpheroRulerビーズの画像。スケールバー:5 μm。
(B)SRRF-Stream超解像イメージングで撮影したSpheroRulerビーズの画像。スケールバー:5 μm。
(C)(A)の一部を拡大した画像。スケールバー:1 μm。
(D)(B)の一部を拡大した画像。スケールバー:1 μm。
(E)(C:紫色)および(D:緑色)中の実線に沿った蛍光強度の分布図。
画像提供:Dr. Yao Baoli(Xi'an Institute of Optics and Precision Mechanics, Chinese Academy of Sciences, 20lksehg)

イメージング条件が及ぼす影響をSpheroRulerを用いて評価した例

画像内容説明

SpheroRulerビーズを63倍油浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡観察し、さまざまなイメージング条件で画像を取得した。条件によって解像度や画質が異なっていることが分かる。このように、SpheroRulerビーズはイメージング条件を検討する際の評価基準として用いることも可能である。
画像提供:Dr. Kseniya Korobchevskaya(Institute of Developmental & Regenerative Medicine, University of Oxford, UK)



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FAQ

Q-1. SpheroRulerビーズは何でできていますか?

A-1. SpheroRulerビーズは、ポリマーからなる粒子です。647 nmまたは488 nmレーザーで励起可能な蛍光色素が粒子の表面に共有結合で固定されています。ビーズは単分子局在顕微鏡法(SMLM)によって二次元または三次元画像に再構成されるとそれぞれ中空のリングまたは球として観察されます。


Q-2. SpheroRulerはどのようなイメージング手法に対応していますか?

A-2. SpheroRulerビーズは蛍光色素でコーティングされており、単分子局在顕微鏡法(SMLM)で安定した明滅(Blinking)を示します。もともとはDirect stochastic optical reconstitution microscopy(dSTORM)のために開発されましたが、SRRF、走査型電子顕微鏡、共焦点顕微鏡、Airyscan共焦点顕微鏡で使用実績があります。


Q-3. SpheroRulerのビーズサイズはどのくらい正確ですか?

A-3. SpheroRulerビーズを構成する球状粒子は、非常に優れた単分散特性に基づいて選択されています。ビーズ直径の精度と再現性は、25個の独立したビーズを走査型電子顕微鏡で測定した結果、標準偏差1±0.05 μmを示しました。


Q-4. SpheroRulerキットには何が含まれていますか?付属品以外に必要なものはありますか?

A-4. SpheroRulerキットには、50 μlのSpheroRulerビーズ懸濁液が含まれています。Blinking観察用のバッファー、カバーガラス、イメージング容器は付属しませんので別途ご用意下さい。


Q-5. 1つのSpheroRulerキットで何回実験できますか?

A-5. キット1つには50 μlのSpheroRulerビーズ懸濁液が含まれており、35 mmのガラスボトムディッシュで推奨使用量5 μlを使用した場合、10回の実験が可能です。


Q-6. 生物試料と一緒に使用できますか?

A-6. はい、SpheroRulerビーズはPBSに懸濁されていますので、生物試料(細胞、組織切片など)と併せて使用することができます。


Q-7. SpheroRulerはどのくらいの期間保存できますか?

A-7. SpheroRuler懸濁液は4℃で保存した場合、少なくとも7か月間安定です。


Q-8. 再構成によってSpheroRulerからどんな画像が得られますか?

A-8. 二次元観察の場合、空洞の円の画像が得られます。三次元観察では中空の球の画像が得られます。


Q-9. 再構成アルゴリズムの推奨はありますか?

A-9. SpheroRulerビーズは、高密度の蛍光色素でコーティングされた蛍光ビーズです。個々の明滅(Blinking)の効率的な局在化を図るために、「single-emitter/low density」ではなく、「multi-emitter/high density」のアルゴリズムを使用することをおすすめします。利用可能なアルゴリズムは使用するイメージングシステムによって異なりますが、一例としてZENソフトウェア(Zeiss社)の 「Account for overlap」機能は過去の使用実績があります。


Q-10. 直径測定において、蛍光色素の厚みはどのように考慮すべきですか?

A-10. 蛍光色素はリンカーや抗体を介さずにビーズ表面に直接コーティングされているため、その厚みは直径の測定値に比べて無視できる程度です。蛍光リングの見かけの厚さは、ご使用のイメージングシステムの分解能に依存します(dSTORMで測定した場合、約160~200 nm)。直径を測定する際は、ビーズの外縁を考慮する必要があります。


Q-11. ビーズを3Dで再構成する際に完全な球形が得られません。これは正常ですか?

A-11. SpheroRulerビーズの2D再構成は正確な円形であるべきですが、z軸方向に細長い形状が得られることは一般的なアーティファクトであり、イメージングや3D再構成に使用したシステム(バイプレーン再構成、非点収差など)に依存します。z軸方向における直径の測定値と1 μmからの差は、用いるシステムにおけるz再構成の正確さを評価するためのロバストな指標として使用することが可能です。一例として、バイプレーン撮影を使用したVutara VXLシステムでテストした場合、測定されたzの直径はを示しました。


Q-12. 再構成の解像度と正確さを最大化するにはどうすれば良いですか?

A-12. SpheroRulerビーズには高密度の蛍光色素がコーティングされています。下記にSpheroRulerによる再構成を容易にするためのいくつかのヒントを記載します。

  • ローカライゼーションの精度を向上させるため、事前に超高出力(例:レーザー80%で30秒以下)で照射する「ポンピング」ステップを必ず実行して下さい。
  • 「multi-emitter/high density」アルゴリズム、または同等のものを使用し、個々の明滅(Blinking)イベントの効率的な定位を行って下さい。
  • それでも効率的に球を再構成するのに十分でない場合、またはそのようなアルゴリズムが利用できない場合は、PSF(点像分布関数)フィルタを使用して焦点が合っていないイベントや近接した二重エミッタを除去することで、ローカライゼーションの精度が向上し、再構成の正確さが向上します。



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(テクニカルサポート 試薬担当)

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