Molecular glue（分子糊）とPROTACの試験およびプロファイリング用キット Molecular Glue/PROTAC Optimization Kitシリーズ （BPS Bioscience社）

従来、タンパク質の活性制御のアプローチは阻害物質やリガンドを用いた直接的なタンパク質相互作用に依存していました。しかし、これらは既知の4,000種類の疾患関連タンパク質のうちのわずか約10%のみが対象であり、多くは四次構造のため「薬物治療不可能」とみなされています。近年、標的タンパク質分解（Targeted Protein Degradation、TPD）と呼ばれる細胞自身のタンパク質分解機構の力を活用し、「薬物治療不可能」なタンパク質を標的とする新しい戦略が開発されています。TPDは阻害物質とは異なり非化学量論的に作用するため、ごく少量で済み、細胞内のすべてのタンパク質機能に影響を及ぼし、薬剤耐性の発生につながる傾向はありません¹。これらの特性は、がん、神経変性疾患、炎症性疾患、感染症の治療に大きな臨床的利点をもたらします。そのため、TPDは、特に新しい治療戦略の開発を目指す製薬会社に注力されている研究分野となっています。

真核細胞は、タンパク質の合成から分解まで、タンパク質の質を制御するために非常に複雑で相互に関与する経路を発達させてきました。タンパク質恒常性システムのどこかの段階で不均衡があると、野生型または変異型タンパク質が蓄積し、最終的には病気を引き起こす可能性があります。欠陥のあるタンパク質は、プロテアソーム、ユビキチンプロテアソームシステム（UPS）、またはリソソームにより除去されます。タンパク質を分解するためには、タンパク質のユビキチン化が必要です。これは、E1（ユビキチン活性化酵素）、E2（ユビキチン結合酵素）、およびE3リガーゼを含む多段階のプロセスで、1つまたは複数のユビキチン（Ub）が標的タンパク質に共有結合します。Ubタンパク質の行き先は、どのリジンがユビキチン化されるかによって決定され、K48ポリユビキチン化はプロテアソームに、K63はリソソームに標的化されます。リソソームは、細胞小器官、タンパク質凝集体、病原体も消化し、エンドサイトーシス、貪食、またはオートファジーを介して細胞の「ゴミ」を受け取ります。疾患関連タンパク質の除去にプロテアソームおよびリソソームシステムを利用するいくつかの戦略が考案されており、その中には、PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras、Arvinas, Inc. の登録商標)、Molecular glue（Molecular glue）、LyTAC（Lysosome-Targeting Chimera）などがあります（☞ 下表参照）。

PROTACは、プロテアソーム内でタンパク質分解を引き起こす、最初に開発されたTPD技術の1つです。これらは、標的タンパク質（protein of interest、POI）結合ドメイン（ペプチドまたは低分子）、リンカー、および E3リガーゼリガンドで構成されています。形成された三元複合体内のPOIとE3リガーゼの近接性により、ユビキチンがPOIに転移し、分解の標的となります。

PROTACは、キナーゼ、転写因子、GTPaseなど、がんに関与するさまざまなタンパク質を対象に開発されてきました。BTK（Bruton tyrosine kinase）、p38、BCL-xLを標的とするPROTACの例は、この技術のさらなる利点を示しています。BTKは慢性リンパ性白血病に関与しており、低分子阻害物質であるIbrutinibをベースにしたPROTACは野生型だけでなく変異型タンパク質も分解しますが、Ibrutinibは野生型タンパク質のみを標的とします。P38はがんにおける細胞の生存、移動、増殖に関与しており、4つのアイソフォームが知られています。同じ単一の阻害物質、同じE3リガーゼ、および異なるリンカー結合部位で構成されるPROTACのアイソフォーム固有のTPDによって、複雑なアイソフォーム固有の阻害物質を開発する必要性はなくなりました。

BCL-xL（B-cell lymphoma-extra-large）は、多くの種類のがんで過剰発現しています。現在のBCL-xL阻害物質は血小板も標的にするため、重篤な副作用を引き起こす可能性があります。しかし、選択されたE3リガーゼがCBRNのように血小板で非常に低いレベルで発現しているPROTACのコンテキストで阻害物質を使用すると、BCl-xLの分解をがん細胞に限定でき、患者の生活の質が大幅に向上します^1～4。さまざまな文献においてPROTACががん治療に幅広く応用され、その可能性を示唆されています。最近、PROTACの精製戦略が研究されており、リン酸化PROTACや光PROTAC¹など、特定の細胞条件下でのみ機能するPROTACが開発され、この技術の特異性が広められています。

PROTACはウイルス感染症の治療にも使用できます。一例として、C型肝炎（HVC）の治療では、PROTACはTelaprevir（HCVプロテアーゼ阻害物質）を用いて HVC NS3/4aプロテアーゼの分解を誘導します¹。SARS-CoV-2を標的とするPROTACは、重症患者に対する有用な治療アプローチとなる可能性があります。

Molecular glue（MG）分解物質にはリンカーはないもののPOIとE3リガーゼを結合し、PROTACと同様の結果をもたらします。PROTACとは異なり、MGはE3リガーゼを標的タンパク質に直接動員するのではなく、標的タンパク質とE3リガーゼの相互作用を安定化し、標的のユビキチン化を促進します。MGは分子量が低くPROTACよりもコンパクトですが、その設計はより複雑であるため、これまでに開発されたMGの数は限られています。例としては、転写因子IKZF1/3をE3リガーゼCRBNに結合するThalidomideとPomalidomideがあります¹。二重メカニズム分解物質は、PROTACとMolecular glueの特性を1つの分子に組み合わせることができます。一例がGBD-9で、CRBNを動員することでBTKとGSPT1（G1 to S phase transition 1） のMGを分解するPROTACとして機能します^1,5。

LyTACはPOIリガンド、リンカー、およびLysosome targeting receptor（LTR）リガンドによって形成され、リソソーム分解を利用して標的物質のポートフォリオを拡大し、標的物質のプールを膜および細胞外タンパク質にまで拡張します。POIとTRLとの三者複合体の形成によりエンドサイトーシスが起こり、最終的にリソソームで分解されます。組織特異的LTRの使用によりLyTACは組織特異的になり、すべての臓器を標的とし重大な副作用をもたらす可能性のある阻害物質の使用は避けられます。LyTACはPROTACよりも新しく、神経変性疾患、自己免疫疾患、およびがん治療に応用されています。たとえば、エンドサイトーシスを誘発するpoly-M6P（Mannose-6-Phosphate）を抗EGFR抗体に結合させたり、poly-M6Pを抗PD-L1抗体に結合させたりすることで、EGFRとPD-L1が分解されます¹。リソソーム経路を標的とする他のいくつかの方法が開発されており、治療への応用に大きな期待が寄せられています（☞ 下表参照）。

CDK（Cyclin-Dependent Kinase）は、多くの重要な細胞機能に関与するセリン／スレオニンキナーゼです。CDK/Cyclin Kは、転写調節、DNA損傷修復、ゲノム安定性に関与することで、がんやその他の疾患において病態生理学的に重要な役割を果たしています。CDK12/13は、RNAポリメラーゼⅡのC末端ドメインのSer2をリン酸化することで転写を調節し、DNA損傷応答（DDR）に関連するタンパク質の発現を調節します。CDK/Cyclin Kのメカニズムと不活性化によるゲノム不安定性の誘発の仕組みを理解することは、疾患に対する標的療法や個別治療戦略の開発につながる可能性があります。

DDB1（DNA damage-binding protein 1）は、Cullin 4（CUL4）ベースの E3ユビキチンチガーゼ複合体の中核成分として機能します。(R)-CR8などのMolecular glueは、CDK12/Cyclin KとCUL4アダプタータンパク質DDB1との複合体形成を誘導し、CDK12/Cyclin Kをユビキチン化および分解を促進します。CR8は、Cyclin Kの一価分解物質として作用することでpan-CDK阻害物質と見なされています。CR8は、溶媒側に出たピリジン環非含有のCDK阻害物質であるSeliciclibから派生したものです。CR8に溶媒側に出たピリジン環を導入することで新しい作用機構が発生し、低分子構造の改変が革新的なツールを生み出すことになりました。これらのMolecular glueとPROTACの開発により、がん治療に新たな道が開かれれることが期待されます。

CDK2（Cyclin-Dependent Kinase 2）は、細胞周期のG1期からS期への移行に特に関与する細胞周期調節因子です。Cyclin EおよびCyclin Aと複合体を形成し、DNA複製および細胞周期の進行に関与する主要な基質をリン酸化します。CDK9（Cyclin-Dependent Kinase 9）は主に転写を制御します。CDK9はPositive Transcription Elongation Factor b（P-TEFb）複合体の触媒コアを形成し、RNAポリメラーゼⅡのC末端ドメイン（CTD）をリン酸化して転写伸長を促進する上で重要な役割を果たします。

CDK9は、特に血液悪性腫瘍におけるがん治療の新たな標的物質になっています。HIV複製にも関与しているため、抗HIV療法の潜在的な標的物質です。CDK9阻害物質は、炎症性疾患や心血管疾患の治療における有用性について研究されています。CDK2は、腫瘍学、特に細胞周期制御の調節不全を伴うがんにおいて、十分に検証された標的物質であり、特定の神経変性疾患にも関与している可能性があります。またCDK2は、Kisqali、Verzenio、IbranceなどのCDK4/6阻害物質によるエストロゲンレセプター陽性の乳がん患者が治療後に獲得する耐性機構であることが明らかにされており、これはCDK2活性を直接調節するCCNE1（cyclin E1）の上方制御によって引き起こされる現象です。多くのCDK2阻害物質が開発中ですが、薬物治療が比較的難しいために標的外の毒性効果が問題となっています。低分子阻害物質に代わるものとして、分解物質が考えられています。CDK2とCDK9はいずれも臨床研究が進行中であり、がんを含むさまざまな病状の臨床試験において、種々の阻害物質が試験されています。

DCAF15は、E3タンパク質リガーゼ複合体DDB1-DDA1-CUL4-Rbx1の基質結合成分であり、標的タンパク質のユビキチン化とプロテアソーム分解に関与しています。DCAF15が基質タンパク質に結合すると、E3リガーゼ複合体の活性が引き起こされ、タンパク質基質のユビキチン化と最終的な分解が起こります。DCAF15の最も重要な標的物質の1つは、腫瘍を標的としたmRNAおよびタンパク質発現の重要な因子であるRBM39（RNA-binding motif protein 39）です。最近の研究で、RBM39が予想に反してアリールスルホンアミドの標的物質であることが明らかになりました。この物質は、RBM39とE3ユビキチンリガーゼ構成因子であるDCAF15間のMolecular glueとして機能し、標的物質を選択的に分解します。

E7820はアリールスルホンアミドの一つで、RBM39をRbx-CUL4-DDA1-DDB1-DCAF15 E3リガーゼ複合体に動員し、プロテアソームによるユビキチン化と分解を引き起します。将来、RBM39の動員に関与する新しいMGとPROTACの開発によるDCAF15を用いた他の目的タンパク質の分解への応用が期待されます。