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チタン製三次元細胞培養用スキャフォールド ツェレッツ™(zellez™)

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:7030

毛髪より細いチタン繊維の不織布からなる,細胞培養用スキャフォールドです。
本製品は北海道大学 名誉教授 久保木 芳徳 先生が開発した三次元スキャフォールドを製品化したものです。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


ツェレッツ 製品外観(外径⌀13 mm×厚み1.5 mm)

製品外観(外径⌀13 mm×厚み1.5 mm)

ツェレッツ 拡大図(線径50μm)

拡大図(線径50μm)

ツェレッツ内で増殖する骨芽細胞のアクチン染色像

ツェレッツ™内で増殖する骨芽細胞のアクチン染色像

特長

  • チタン製で強固なため,潰れたり変形したりしにくく,取り扱いやすい特性を有しています。
  • 三次元効果により,各種細胞の分化誘導や,コラーゲンなどの有用物質の産生促進に適しているのみでなく,生体に近い状態での大量培養に適しています。
  • 一般的な二次元培養と比較し,骨芽細胞から分泌されるアルカリホスファターゼ活性増大は2倍以上,結合組織細胞のコラーゲン産生増大も2倍以上の効果を示しています。
  • 生体親和性の高いチタンを用いているため,in vivoへの応用も可能です。

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ツェレッツ™とは

■ 三次元培養が求められる理由

現在,多くの研究室では培養皿上での二次元的な細胞培養が行われています。培養皿上に拡がった二次元的に培養された細胞は,生体内に存在する細胞とは形態的に異なり,生体内での本来の機能および現象を再現できていない例が知られています1。それは,従来の培養方法では細胞の外部環境を再現できていないことが要因であると考えられます。培養細胞を用いて生命現象を可能な限り再現するため,実験に使用される動物への負担を減らすため,そして細胞から組織を作る再生医療の実現のために立体的な三次元培養法の確立が求められています。

■ 三次元培養の現状

三次元培養を実現するための多種にわたる三次元培養用スキャフォールドが開発されています。これらは樹脂,ゲル,セラミックスなどの合成分子により構成されていますが,まだ課題が残っています。

三次元培養を実現するには,細胞,細胞外基質(Extracellular matrix:ECM),制御因子が必要であると言われています。ツェレッツ™は,北海道大学 名誉教授 久保木 芳徳 先生が人工ECMの幾何学的性質について研究を重ねた結果,生体内で組織を再生するためには適切な空隙を持った人工ECMが必要であることを見出し,その要素を高い生体親和性と強度を持ったチタンで実現した細胞培養用スキャフォールドです2~4。実際にツェレッツ™を用いたインプラントを使用することで,細胞がチタン繊維内に侵入して増殖し,インプラントの早期安定性を示す結果が得られています5~10。これらの結果から,細胞培養プレートに置いたツェレッツ™内で細胞を培養することにより,生体内に近づいた状況で培養を行うことが可能になると期待され,実際にツェレッツ上で培養した細胞は多層構造を形成することが知られています11。チタン繊維を用いているため,それぞれの細胞,培養目的に合わせて線径,空隙率,直径,厚みなどを変化させた製品を作製可能です。また,ハイドロキシアパタイトやコラーゲンなどの生体分子によるコートも可能です。

■ ツェレッツ™を使用する利点

ツェレッツ™を構成するチタンは,生体親和性に優れていることが知られており,人工骨,人工歯根など生体内に移植する医療機器の材料として用いられています。ハイレックスコーポレーションが提供するツェレッツ™は,組織再生に最適な人工ECMの幾何学という概念をもとに開発され,医療機器の素材としても使用可能な細胞培養用スキャフォールドです。生体内の環境に近い細胞培養,将来的に医療につながる細胞培養を行いたい研究者の方々ににお使いいただける製品です。

参考文献

1. Abbot, A., et al., Nature, 424, 870~872 (2003).
2. 久保木芳徳 他,ティッシュエンジニアリング, 24~33 (2006).
3. 久保木芳徳 他,再生医療, 5 (3), 20~30 (2006).
4. Kuboki, Y., et al., Transworld Res. Network, 1~27 (2008).
5. Vehof, J. W., et al., Plast Reconstr. Surg.,108, 434~443 (2001).
6. Vehof, J. W., et al., J. Biomed. Mater. Res.,61 (3) 440~449 (2002).
7. Takita, H., et al., J. Biomed. Mater. Res., A, 71 (1) 181~189 (2004).
8. Kuboki, Y., et al., Arch. Biocera Res.,5, 146 (2005).
9. Nakade, T., et al., Arch. Biocera Res.,5, 277 (2005).
10. Jansen, J. A., et al., J. Control Release,101, (1-3) 127~136 (2005).
11. Li, Dong, et al., J. Hard Tissue Biology,14, 333~334 (2005).


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ツェレッツ™上に播種した線維芽細胞,間葉系幹細胞のin vitro解析

ツェレッツ™上でMouse Embryonic fibroblastを培養し,細胞の増殖を計測した。また,ヒト間葉系幹細胞をプラスチックディッシュとツェレッツ™上で培養し,培養物から抽出されたコラーゲンの量を測定した。また,細胞内のアルカリホスファターゼの活性を測定した。線維芽細胞を直径5 mmのツェレッツ™上に播種した場合,6日後には同面積の96 well上と比較して2倍以上の細胞が存在することが明らかになった(図1)。また,間葉系幹細胞の培養物中に存在するコラーゲンの量は約5倍に上昇した(図2)。骨形成の活性の指標となるアルカリホスファターゼ活性は約2倍に上昇した(図3)。これらの結果は,ツェレッツ™が細胞に良好な環境を提供し,増殖,分化を促進させていることを示唆している。


マウス線維芽細胞をツェレッツ上に4,000個播種した。

図1:マウス線維芽細胞をツェレッツ™上に4,000個播種した。1,6,10日後のツェレッツ™上の細胞から抽出したDNA量を測定し,その値からツェレッツ™上に存在する細胞の数を計算した。また,ほぼ同面積の96 wellプレート上の細胞数も計測した。


ヒト間葉系幹細胞のツェレッツ上での骨芽細胞への分化誘導時のコラーゲン分泌量

図2:ヒト間葉系幹細胞をプラスチックディッシュとツェレッツ™上に播種し,骨芽細胞への分化誘導剤であるDexametahazone(Dex)の有無の条件下で2週間培養し,培地中に分泌されたコラーゲンの量を定量した。
ヒト間葉系幹細胞はプラスチックディッシュ上ではDexの存在によりコラーゲンの分泌量が増える。ツェレッツ™上で培養するとDex無しでもコラーゲンの分泌量が増える。
このことはツェレッツ™上で培養することで間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化が促進されることを示唆する。


ヒト間葉系幹細胞のツェレッツ上での骨芽細胞への分化誘導時のアルカリホスファターゼ活性

図3:ヒト間葉系幹細胞をプラスチックディッシュとツェレッツ™上に播種し,骨芽細胞への分化誘導剤であるDexametahazone(Dex)の有無の条件下で2週間培養し,ウェル内の細胞のアルカリホスファターゼの活性とDNA量を測定した。両者から細胞あたりのアルカリホスファターゼ活性を計算した。
ヒト間葉系幹細胞はプラスチックディッシュ上ではDexの存在により1細胞あたりのアルカリホスファターゼの活性が上昇する。ツェレッツ™上で培養するとDex無しでもアルカリホスファターゼ活性が高い。
このことはヒト間葉系幹細胞がツェレッツ™上で培養することによってDex無しでも骨芽細胞に分化することを示唆している。


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ツェレッツ™上で培養した細胞の実例と人工歯根への応用例

ツェレッツ™にMC3T3-E1骨芽細胞を播種し,14日後の状態を観察したところ,骨芽細胞はチタン線の隙間を充填するように塊を形成している様子が観察された(図4)。この結果は,細胞がツェレッツ™の中で三次元的に培養されることを示している。

ツェレッツ™と同質のチタン不織布をチタン基幹(チタンロッド)に巻いて作製した人工歯根モデル(インプラント)を,ウサギの頭蓋骨に埋め込んだ。移植後6週間後の骨の切片写真を観察すると,チタン不織布の内部に骨組織が形成され,インプラントと骨が強固に癒合している様子が観察された(図5)。この結果から,ツェレッツ™を構成するチタン不織布は,良好な生体親和性を示し,組織再編の基材として適していることを示している。これらの結果は,ツェレッツ™を用いて細胞を培養することで生体内の組織に近い状態での細胞培養を実現できる可能性を示唆している。


骨芽細胞の形態

図4:ツェレッツ™に骨芽細胞を播種し,14日後の細胞の形態を観察した。

人工歯根モデル

図5:チタン基部をチタン不織布で覆って作製した人工歯根モデルをウサギの頭蓋骨に埋め込んだ。6週後に取り出した患部をHE染色した。


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チタン線径と空隙サイズおよび空隙率との関係

線 径20μm50μm
平均空隙サイズ(下図参照)面方向:110μm,厚み方向:80μm面方向:260μm,厚み方向:150μm
空隙率87%87%
チタン線径20μmで空隙率87%のツェレッツの断面SEM像

チタン線径20μmで空隙率87%のツェレッツ™の断面SEM像

チタン線径50μmで空隙率87%のツェレッツの断面SEM像

チタン線径50μmで空隙率87%のツェレッツ™の断面SEM像

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製品仕様

仕 様備 考
材 質純チタン純チタンJIS第1種
線 径20±10μm繊維断面検査により換算
50±10μm
寸 法⌀5±0.2 mmデジタルノギスで測定
⌀13±0.2 mm
空隙率87%寸法,厚さ,重量より計算

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これまでに培養実績のある細胞種

  • MC3T3-E1
  • ヒト間葉系幹細胞
  • マウス胎児由来線維芽細胞
  • HEK293T
  • HT-29
  • HepG2
  • HaCaT

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FAQ

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価格

[在庫・価格 :2022年05月21日 00時14分現在]

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チタン製三次元培養用スキャホールド。
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保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ 再生医療研究細胞培養カタログ2017-2018 p.33
ニュース2021年2月15日号 p.4
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ツェレッツ φ5mm, 線径20μm

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(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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