免疫アッセイの非特異的結合や夾雑物による干渉を抑制するバッファー LowCross-Buffer

ELISAやイムノブロッティングなどの免疫アッセイにおける抗体の非特異的結合、交差反応およびマトリックス干渉を最小化し、検出感度や信頼性を向上することができる試料や抗体の希釈用バッファーです。

※ CANDOR Bioscience社のその他のイムノアッセイ用バッファーについてはこちらをご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

＊ ELISAおよびタンパク質アレイでは、1：2またはそれ以上に希釈して使用することができます。標準試料と試料は、厳密に同じ希釈率で処理する必要があります。一次抗体および二次抗体の希釈に使用する場合は、抗体の製品データシートの推奨希釈率に従って、希釈率を決定して下さい。
※ 本製品はアッセイバッファーとして使用可能ですが、ELISAのウェルやメンブレンなどの表面は別にブロッキング試薬で処理する必要があります。ブロッキング試薬には、The Blocking Solution（#110050/50 ml、#110125/125 ml、#110500/500 ml）のご使用をお勧めします。

※ Dr. Ch. Specht（PARA BioScience社、グローナウ）提供

HAMA（Human Anti-Mouse Antibodies）およびRF由来の干渉に対する本製品の有効性を確認するために、市販のHAMAおよびRF陽性のヒト血液試料（in. vent diagnostica社、ドイツ）を試料として、本製品を不使用（左）または使用した場合（右）において、HAMA-ELISA Kit（Medac社、ドイツ、CE認証済み）でHAMA血清およびRF由来の干渉を定量した。

HAMAは、マウスの免疫グロブリンを認識するヒト抗体で、測定において偽陽性や偽陰性の要因となる。
HAMAによる干渉に対する本製品の有効性を確認するために、in.vent diagnostica社（ドイツ）とScantibodies社（米国）のHAMA陽性ヒト血液血清パネルを試料として用いた。下図では、HAMA-ELISAで陽性と判定された血清試料のデータのみを示しているが、本製品を使用して効果を示さなかったHAMA陽性血清はなかった。本製品により、HAMA陽性試料の干渉をバックグラウンドレベル（＜40 ng/ml、HAMA ELISAマニュアルに基づく指標）にまで低減した。

Q-1. LowCross-Buffer固有の効能は何ですか？

A-1. LowCross-Bufferは、イムノアッセイ（ELISA、ウエスタンブロッティング、タンパク質アレイ、およびイムノPCRなど）用に新しく開発されたサンプルバッファーです。非特異的結合、交差反応性、およびマトリックス効果などによる干渉の低減に有用です。抗体－抗原間の高い親和性結合は悪影響を受けませんが、交差などの抗体の不要な結合は抑制されます。

Q-2. どうしてLowCross-Bufferはマトリックス効果を低減できるのですか？

A-2. マトリックス効果のほとんどは、マトリックス成分（ヒト血清試料からの血清タンパク質など）の分析物または抗体への望ましくない低～中程度の親和性結合が原因となります。測定物質がタンパク質または試料の他の成分によってマスクされると、抗体は測定物質に結合できません。また、抗体がマトリックス成分でマスクされることもあります。LowCross-Bufferは、この抗体のマスキングを低減します。

Q-3. LowCross-Bufferをどのように使用すべきですか？

A-3. それは干渉の状況によります。非特異的結合または交差反応性が検出抗体に由来する場合は、検出抗体をLowCross-Bufferで希釈することをお勧めします。

Q-4. LowCross-Bufferを希釈する必要はありますか?

A-4. いいえ。LowCross-Bufferは、Ready-to-useでそのまま使用できます。試料または検出抗体は、直接希釈します。競合法、および免疫組織化学の一部のアプリケーションで使用する場合のみ、LowCross-Bufferを水または生理学的バッファーで希釈することが有用です。この場合は、最適混合比をご自身で前もって試験を行い、決定して下さい。

Q-5. LowCross-Bufferはモノクローナル抗体やポリクローナル抗体とともに使用できますか？

A-5. はい。しかし、ポリクローナル抗体を使用する場合、親和性の異なる多くの抗体からなるポリクローナル抗体の組成に注意する必要があります。LowCross-Bufferは、高い親和性結合のみを許容しますが、低～中程度の親和性の結合は低減します。したがって、LowCross-Bufferを使用するにあたりポリクローナル検出抗体の濃度を適度に上げる必要がある場合があります。抗体濃度の増加は高い親和性の抗体濃度も増加させますが、LowCross-Bufferは低～中程度の親和性の抗体の結合を阻害します。アッセイにおいて、抗体濃度を上げる必要があるかどうかは、抗体の品質に依存します。

Q-6. バッファー組成は、酵素的な検出の呈色反応に影響を及ぼしますか？

A-6. LowCross-Bufferは、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼの酵素活性に悪影響を及ぼしません。標識された検出用抗体をLowCross-Bufferでインキュベートすることにより、酵素活性の増加が見られる場合があります。

Q-7. サンドイッチELISAでHRP標識二次抗体を使用する際に高いバックグラウンドが出てしまいます。その理由とLowCross-Bufferが改善に役立つか教えて下さい。

A-7. 二次抗体が他の哺乳動物種の他の抗体に対して前もって吸着されているかどうかを知ることは重要です。ウサギIgGに対する二次抗体は、マウスやヤギなどの他の動物種の抗体に対して精製されていない場合、それらの動物種のIgGと高い親和性で交差反応することがあります。その原因は、哺乳類の抗体の高い配列相同性です。二次抗体は精製（前もっての吸着）がなされていないことが多いため、高い親和性で交差反応します。この場合は、LowCross-Bufferでは改善できません。二次抗体を捕捉用抗体と交差反応しない事前に吸着された抗体に変更する必要があります。

Q-8. タンパク質アレイにおいて蛍光色素とともにLowCross-Bufferを使用できますか？

A-8. はい。タンパク質アレイにおいて、ポジティブな結果が出ています。いくつかの適用においてシアン色素（Cy5, Cy3, Oysterなど）を使用する場合、蛍光の増加が観察される可能性があります。

Q-9. LowCross-Bufferは何回くらい凍結および融解できますか？

A-9. 数回凍結、融解を行っても問題ありません。しかし、使用前に十分に混合することが重要です。

Q-10. ウエスタンブロッティングのメンブレンやELISAプレートなどの表面において、ブロッキング溶液をLowCross-Bufferに変更することは可能ですか？

A-10. いいえ。LowCross-Bufferは表面のブロッキングバッファーではなく、試料や抗体の希釈用バッファーです。ブロッキングには、The Blocking Solution（#110050/50 ml、#110125/125 ml、#110500/500 ml）のご使用をお勧めします。これは、従来のブロッキング試薬よりもはるかに優れています。