光で制御可能！細胞分裂前中期の染色体輸送調節試薬 PCEI-HU （Photoswitchable CENP-E Inhibitor）

有糸細胞分裂のM期において、染色体輸送モータータンパク質（CENP-E）の活性を光照射によりOn/Offすることで、染色体移動を可逆的に抑制・再開させることのできる試薬です。
可視光照射で染色体の移動を抑制し、UV光照射で再開させることができます。染色体が完全に赤道面に整列するまでは繰り返し調節可能です。M期の染色体移動に関与するタンパク質の機能評価や紡錘体形成チェックポイント（SAC）の研究に有用です。

※ 本製品は北海道大学 玉置信之教授、上原亮太准教授らの研究成果をもとに、フナコシ株式会社が製品化し、販売しています。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

PCEI-HUは既知のCENP-E阻害剤の基本骨格に光異性化反応を示すアゾベンゼン構造を導入した化合物です。UV光および可視光を照射することで、アゾベンゼン部位がcis-trans光異性化反応を起こし、構造が大きく変化するため、CENP-E阻害能に大きく差が生じます。これによりCENP-Eの活性を可逆的に制御可能です。

※ 注意点
染色体の赤道面への輸送が完了後は、本試薬では染色体の輸送を制御することはできません。UV光照射後の反応時間には注意が必要です。詳しくは☞ アプリケーションデータをご参照下さい。

 本試薬の保存方法   光照射について   光異性化平衡について   UV照射後のCENP-E非阻害型の安定性   ライブイメージングによるタイムライプス観察時の注意   長期培養による細胞毒性について 

本試薬は遮光状態で保管して下さい。特にDMSOストック溶液調製後は小分注し、それぞれ遮光環境下で保管して下さい。環境光による異性化反応を抑えるため、できるだけ1回で使い切ることを推奨しています。

※いずれも照射する光の波長によって照射条件は異なりますので、上記を参考にお使いの実験系に応じてご検討下さい。

CENP-E阻害型とCENP-E非阻害型は光異性化の平衡状態にあり、十分なUV光（365 nm）照射後のCENP-E阻害型／CENP-E非阻害型は7%／93%、十分な可視光（510 nm） 照射後のCENP-E阻害型／CENP-E非阻害型は86%／14%と見積もられています。光照射により完全に片方に変換できるわけではありませんのでご注意下さい。

UV照射後のCENP-E非阻害型は37℃暗所下において少なくとも24時間安定なことが確認されています。

本試薬PCEI-HUは光応答性試薬のため、ライブイメージングでタイムラプス観察する際には、観察蛍光波長に注意が必要です。観察時の励起波長により阻害活性が変化する可能性があります。励起波長630 nm以上の近赤外蛍光色素・蛍光タンパク質であれば本試薬のcis-trans光異性化反応に影響なくタイムラプス観察が可能です。

CENP-E阻害型の条件下で長時間培養すると細胞分裂が停止し、紡錘体形成チェックポイントにより細胞死が誘導される可能性があります。
※ 参考：☞ PCEI-HUの長期培養における細胞毒性をご参照下さい。

 PCEI-HUの光応答性と繰り返し変換効果   PCEI-HUの光依存的なCENP-E活性（ATPase活性）の阻害能   PCEI-HUの長期培養における細胞毒性 

 光照射による染色体・CENP-Eの局在観察   生細胞における繰り返し光照射による染色体輸送制御   染色体輸送完了後のCENP-Eの役割の解明   紡錘体形成チェックポイント関連タンパク質の観察 

HeLa細胞にPCEI-HU （1 μM）およびMG132（20 μM）^＊１ を添加し下記の3つの条件で培養し、PFAで固定化処理した。免疫染色法でCENP-E、α-tubulinおよび染色体（DAPI染色）を観察した。
＊1 MG132は後期への進行阻害剤として使用

条件①でPCEI-HUを添加後光照射せずに培養するとPCEI-HUはCENP-E阻害型として機能し、高頻度で染色体の配置異常が観察された。その際のCENP-Eは両極に濃縮していた。一方、条件②でUV照射しCENP-E非阻害型に変換後に観察すると染色体の赤道面への整列が優位に観察され、CENP-Eも赤道面に局在が観察された。条件③でさらに可視光照射するとPCEI-HUは再度CENP-E阻害型に変換され、条件①同様に高頻度の染色体異常配置が確認され、CENP-Eも両極に局在していた。
以上の結果より、光照射により染色体の配置異常およびCENP-Eの局在を制御できることが分かる。

LLC-PK1細胞に1 μM 近赤外DNA染色試薬（SiR-DNA）を添加し、染色体を可視化した。その後、PCEI-HU（1 μM）およびMG132（20 μM）を添加し2時間暗所で培養したあと、UV光および可視光を繰り返し照射し、染色体の移動を生細胞イメージングで観察した（上図）。特定の染色体の動きをキモグラフで示し、赤道面への距離を評価した（下図）。UV照射時に染色体が赤道面に近づくが、可視光照射により染色体から離れていくことが分かる。この様子は繰り返し観察され、最終的に赤道面に到達した。

HeLa細胞にPCEI-HU（1 μM）およびMG132（20 μM）を添加し、UV光照射後3分（上段）、または30分培養後（下段）、さらに可視光照射し30分間培養した。UV照射後（CENP-E非阻害型）の時間が短いとき、可視光照射（CENP-E阻害型）で再び染色体の輸送を停止することができたことに対し、UV照射後（CENP-E非阻害型）の時間が長く赤道面に整列が完了した場合、可視光照射（CENP-E阻害型）しても再度染色体の配置異常は起こらなかった。このことから、CENP-Eは染色体が赤道面に整列するために必要な因子であって、一度赤道面に整列した後はその機能が不要になることがPCEI-HUを用いることで明らかになった。

紡錘体形成チェックポイントにおける重要タンパク質であるMad2を観察するため、HeLa細胞にMad2-GFPおよびヒストンH2B-mCherryを共発現させ、PCEI-HU（1 μM）およびMG132（10 μM）を添加し次の2つの条件でGFPおよびmCherryの局在を観察した。

両条件ともに、PCEI-HUを添加後、染色体の異常配置が認められ、Mad2は異常配置の染色体に局在が確認された。条件①ではUV光照射後のCENP-Eの活性が維持される時間が短く、染色体の配置異常が解消されていない。この際、異常配置染色体にMad2はまだ共局在していた。一方で、条件②ではCENP-Eの活性が維持される時間が長いため、染色体の赤道面への輸送が完了していた。それに伴いMad2の染色体への局在が解消されていることが観察された。このことから、一度染色体が赤道面に整列したのちにCENP-Eの活性を抑制しても紡錘体形成チェックポイントに影響を示さないことが分かる。

Mafy, N. N., Matsuo, K., Hiruma, S., Uehara, R., and Tamaoki, N., J. Am. Chem. Soc., 142(3), 1763～1767 (2020). [PMID: 31927956]
"Photoswitchable CENP-E Inhibitor Enabling the Dynamic Control of Chromosome Movement and Mitotic Progression."