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NETosisの動的プロセスモニタリングキット Cayman社 NETosis Imaging Assay Kit

掲載日情報:2019/04/15 現在Webページ番号:68750

ex vivoおよびin vitroでNETosisの動的なプロセスを簡便に可視化できるキットです。キットに含まれる細胞透過性のDNA染色蛍光色素(Permeable Nuclear Red reagent)と,細胞不透過性のDNA染色蛍光色素(Extracellular Nuclear Green reagent)を組み合わせることにより,それぞれ好中球の核DNAと好中球より排出されたDNAを継時的に可視化することができます。

初代ヒト好中球をPermeable Nuclear Red reagentおよびExtracellular Nuclear Green reagentで染色し,20nM PMAで刺激した。Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(BioTek社)を用いて,明視野モード,GFPおよびCy5 LED /フィルターセットを使用した蛍光モードで30分ごとに画像を撮影した。すべての核は赤色,膜が損傷した細胞の核だけは緑色に染色される。好中球のNETは,ぼやけた赤色の核を形成後,退色して排出されると緑色のぼやけた雲状に可視化される。

MEMO NETs(Neutrophil extracellular traps)とNETosisとは

NETs(Neutrophil extracellular traps)とNETosisとは (クリックで開閉します)

好中球細胞外トラップ(NET:Neutrophil extracellular traps)は自然免疫系を構築している重要な要素の一つであり,NETが放出される過程は,ネクローシス(Necrosis)やアポトーシス(Apoptosis)とは異なる細胞死としてNETosisと呼ばれます1,2。NETは,DNA,ヒストン,好中球エラスターゼ,ミエロペルオキシダーゼおよびその他の殺菌性タンパク質で構成されています2。NETは,病原体を捕獲・固定化し,マクロファージなどの他の免疫細胞に対してこれらの病原体を除去するよう警告し,また自身も直接的な抗菌活性を有しています3。NETosisのプロセスは何時間もかけて起こり,アポトーシスやネクローシスとは異なる溶解型細胞死を引き起こすことがあります3,4。興味深いことに,好中球は細胞溶解を誘導せずにNETを排出して細胞質体または「好中球ゴースト」になるものの,走化性や食作用機能は保持します3。NETosisやNETの除去に異常または欠陥があると,全身性エリテマトーデス(SLE),乾癬および慢性関節リウマチなどの多くの炎症性疾患や自己免疫疾患の原因となる場合があります。5,6

従来のNETosisの分析方法は,DNAや好中球エラスターゼなどのNET成分の定量化に依存していたため,NETを起こした好中球以外の放出も測定していました。別の方法では,NETosisの過程において,固定化した細胞の可視化が用いられていました。しかしこれらの方法では,パラメータを単一の時点で定量化しなければならず,NETosisの動態を研究するのは困難でした。これらの問題解決のため,Cayman Chemical社ではNETosisの発生プロセスの研究のため,ハイコンテントイメージングシステムを用いた簡単な染色プロトコルを開発しました。

参考文献

  1. Brinkmann, V., et al., Science, 303(5663), 1,532~1,535 (2004). [PMID:15001782]
  2. Dabrowska, D., et al., Scand. J. Immunol., 84(6), 317~322 (2016). [PMID:27667737]
  3. Yipp, B.G., et al.P. Blood, 122(16), 2,784~2,794 (2013). [PMID:24009232]
  4. Gupta, S., et al.J. Immunol., 200(2), 869~879 (2017). [PMID:29196457]
  5. Vorobjeva, N.V., et al.B.V. Biochemistry (Mosc.), 79(12), 1,286~1,296 (2014).
  6. Pinegin, B., et al.Autoimmun. Rev., 14(7), 633~640 (2015). [PMID:25797532]

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特長

  • キットには,ヒトの血液から好中球の濃縮,細胞の染色およびNETosisの誘発のための試薬が含まれています。
  • 細胞染色およびNETosis誘導は,複数の動物種に適応が可能です。
  • 測定試料:新鮮血液(ヘパリン処理*),好中球様細胞株(DMSO-分化HT-60細胞など)
  • 測定方法:蛍光
  • 測定条件:下表参照
  • 測定機器:蛍光顕微鏡,明視野顕微鏡
  • アッセイ数:2×96well plates

他の抗凝血剤は試験していません。EDTAのご使用は避けて下さい。

色素名 励起波長(nm) 蛍光波長(nm) 推奨フィルター 細胞透過性 染色対象
Extracellular Nuclear Green reagent 503 526 GFP/FITC なし 細胞外のDNAおよび膜透過性となった細胞
Permeable Nuclear Red reagent 622 645 Cy5 あり すべての核

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使用例

Extracellular Nuclear Green(細胞不透過性DNA染色色素)を用いたNETosisの検出

NETosisの検出

単離した初代血液好中球をExtracellular Nuclear GreenおよびPermeable Nuclekr Redで染色し,Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(BioTek社)を用いて画像を撮影した。


NETosisの定量化

NETosisの定量化

初代血液好中球をPMAで刺激し,細胞外核陽性細胞を調製した。Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(BioTek社)を用いて画像を撮影した。

  • 左図:各時間で緑色に染色された細胞数を計測し,NETosisを起こした細胞数の定量を行った。
  • 右図:カイネティック曲線の直線部分を使用し,各PMA濃度における毎時のNETosisの割合を計算した。

NETosisを起こした初代ヒト好中球の形態のモニタリング

染色例

PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)(#10008014)またはニゲリシン(nigericin)(#11437)を用いて刺激した好中球が,NETosisの過程で排出したDNAを,Extracellular Nuclear Green reagentによって検出した。正常な核をPermeable Nuclear Red reagentで対比染色した。その後,20倍の対物レンズおよびGFPとCy5のLEDフィルターを明視野で組み合わせ,BioTek社のCytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Readerで各時間ごとの画像を撮影した。は,NETosisを起こした個々の細胞を示す。各画像右下のスケールバーは,30μmを示す。


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キット内容

  • RBC lysis buffer
  • Cell-Based Assay Neutrophil Isolation Histopaque
  • PMA assay reagent
  • A23187 assay reagent
  • Calcium chloride assay reagent
  • NETosis imaging buffer
  • Extracellular Nuclear Green reagent
  • Permeable Nuclear Red reagent
  • Triton X-100 permeabilization control

測定には蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡が必要です。キットには,イメージングに用いる96wellマイクロプレートは含まれていません。


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測定原理および操作方法概略

  1. 単離した好中球を37℃,15~30分間,Permeable Nuclear Red reagentで染色する。
  2. Extracellular Nuclear Green reagentで染色する。
  3. NETosisを誘導物質を添加する。
  4. 明視野,GFPおよびCy5フィルターセットを使用し,プレートを37℃に維持しながら30分ごとに画像を取得してNETosisの動態をモニターする。すべての好中球はPermeable Nuclear Red reagentで染色され,明視野顕微鏡でその核分裂喪失を可視化できる。
  5. NETosisを受けた好中球は,クロマチン脱凝縮を核直径の増加とPermeable Nuclear Redの蛍光強度の減少で検出できる。
  6. 最終的に細胞膜が透過性になると,培地中のExtracellular Nuclear Green reagentにより核が染色される。
  7. Extracellular Nuclear Greenの蛍光の増加によって細胞外へのNETの放出をモニターする。

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FAQ

(詳細はこちらをクリックして下さい。)


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関連製品 NETosis Assay Kit

品名をクリックすると製品の詳細,商品コードをクリックすると製品の価格表をご覧いただけます。

品名 商品コード 測定試料 測定方法 測定波長 製品概要
NETosis Assay Kit 601010 初代好中球 比色 405 nm 好中球の形成したNET(Neutrophil Extracellular Trap:好中球細胞外トラップ)に含まれるエラスターゼの酵素活性を測定するキットです。NETの形成量が推測できます。

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価格

[在庫・価格 :2019年06月24日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数 リスト
NETosis Imaging Assay Kit
10日程度  0 追加
説明文
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ

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[在庫・価格 :2019年06月24日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。

NETosis Imaging Assay Kit

文献数:0

  • 商品コード:601750
  • メーカー:CAY
  • 包装:96tests
  • 価格:¥77,100
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:10日程度 
  • 法規制等:

説明文
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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アポトーシス細胞の検出/抽出キット