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NETosisの動的プロセスモニタリングキット Cayman社 NETosis Imaging Assay Kit

掲載日情報:2019/04/15 現在Webページ番号:68750

ex vivoおよびin vitroでNETosisの動的なプロセスを簡便に可視化できるキットです。キットに含まれる細胞透過性のDNA染色蛍光色素(Permeable Nuclear Red reagent)と,細胞不透過性のDNA染色蛍光色素(Extracellular Nuclear Green reagent)を組み合わせることにより,それぞれ好中球の核DNAと好中球より排出されたDNAを継時的に可視化することができます。

初代ヒト好中球をPermeable Nuclear Red reagentおよびExtracellular Nuclear Green reagentで染色し,20nM PMAで刺激した。Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(BioTek社)を用いて,明視野モード,GFPおよびCy5 LED /フィルターセットを使用した蛍光モードで30分ごとに画像を撮影した。すべての核は赤色,膜が損傷した細胞の核だけは緑色に染色される。好中球のNETは,ぼやけた赤色の核を形成後,退色して排出されると緑色のぼやけた雲状に可視化される。

NETs(Neutrophil extracellular traps)とNETosisとは

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特長

  • キットには,ヒトの血液から好中球の濃縮,細胞の染色およびNETosisの誘発のための試薬が含まれています。
  • 細胞染色およびNETosis誘導は,複数の動物種に適応が可能です。
  • 測定試料:新鮮血液(ヘパリン処理*),好中球様細胞株(DMSO-分化HT-60細胞など)
  • 測定方法:蛍光
  • 測定条件:下表参照
  • 測定機器:蛍光顕微鏡,明視野顕微鏡
  • アッセイ数:2×96well plates

他の抗凝血剤は試験していません。EDTAのご使用は避けて下さい。

色素名 励起波長(nm) 蛍光波長(nm) 推奨フィルター 細胞透過性 染色対象
Extracellular Nuclear Green reagent 503 526 GFP/FITC なし 細胞外のDNAおよび膜透過性となった細胞
Permeable Nuclear Red reagent 622 645 Cy5 あり すべての核

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使用例

Extracellular Nuclear Green(細胞不透過性DNA染色色素)を用いたNETosisの検出

NETosisの検出

単離した初代血液好中球をExtracellular Nuclear GreenおよびPermeable Nuclekr Redで染色し,Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(BioTek社)を用いて画像を撮影した。


NETosisの定量化

NETosisの定量化

初代血液好中球をPMAで刺激し,細胞外核陽性細胞を調製した。Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader(BioTek社)を用いて画像を撮影した。

  • 左図:各時間で緑色に染色された細胞数を計測し,NETosisを起こした細胞数の定量を行った。
  • 右図:カイネティック曲線の直線部分を使用し,各PMA濃度における毎時のNETosisの割合を計算した。

NETosisを起こした初代ヒト好中球の形態のモニタリング

染色例

PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)(#10008014)またはニゲリシン(nigericin)(#11437)を用いて刺激した好中球が,NETosisの過程で排出したDNAを,Extracellular Nuclear Green reagentによって検出した。正常な核をPermeable Nuclear Red reagentで対比染色した。その後,20倍の対物レンズおよびGFPとCy5のLEDフィルターを明視野で組み合わせ,BioTek社のCytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Readerで各時間ごとの画像を撮影した。は,NETosisを起こした個々の細胞を示す。各画像右下のスケールバーは,30μmを示す。


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キット内容

  • RBC lysis buffer
  • Cell-Based Assay Neutrophil Isolation Histopaque
  • PMA assay reagent
  • A23187 assay reagent
  • Calcium chloride assay reagent
  • NETosis imaging buffer
  • Extracellular Nuclear Green reagent
  • Permeable Nuclear Red reagent
  • Triton X-100 permeabilization control

測定には蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡が必要です。キットには,イメージングに用いる96wellマイクロプレートは含まれていません。


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測定原理および操作方法概略

  1. 単離した好中球を37℃,15~30分間,Permeable Nuclear Red reagentで染色する。
  2. Extracellular Nuclear Green reagentで染色する。
  3. NETosisを誘導物質を添加する。
  4. 明視野,GFPおよびCy5フィルターセットを使用し,プレートを37℃に維持しながら30分ごとに画像を取得してNETosisの動態をモニターする。すべての好中球はPermeable Nuclear Red reagentで染色され,明視野顕微鏡でその核分裂喪失を可視化できる。
  5. NETosisを受けた好中球は,クロマチン脱凝縮を核直径の増加とPermeable Nuclear Redの蛍光強度の減少で検出できる。
  6. 最終的に細胞膜が透過性になると,培地中のExtracellular Nuclear Green reagentにより核が染色される。
  7. Extracellular Nuclear Greenの蛍光の増加によって細胞外へのNETの放出をモニターする。

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FAQ

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関連製品 NETosis Assay Kit

品名をクリックすると製品の詳細,商品コードをクリックすると製品の価格表をご覧いただけます。

品名 商品コード 測定試料 測定方法 測定波長 製品概要
NETosis Assay Kit 601010 初代好中球 比色 405 nm 好中球の形成したNET(Neutrophil Extracellular Trap:好中球細胞外トラップ)に含まれるエラスターゼの酵素活性を測定するキットです。NETの形成量が推測できます。

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価格

[在庫・価格 :2019年04月20日 00時11分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数 リスト
NETosis Imaging Assay Kit
10日程度  0 追加
説明文
法規制等
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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[在庫・価格 :2019年04月20日 00時11分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。

NETosis Imaging Assay Kit

文献数:0

  • 商品コード:601750
  • メーカー:CAY
  • 包装:96tests
  • 価格:¥77,100
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:10日程度 
  • 法規制等:

説明文
法規制等
保存条件 法規備考
掲載カタログ

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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アポトーシス細胞の検出/抽出キット