S-パルミトイル化修飾解析について幅広いアプリケーションを行えます ^RapidSPALM, Protein S-Palmitoylation Detection Kitのアプリケーションデータ

タンパク質のS-パルミトイル化修飾を多面的に解析できる^RapidSPALM, Protein S-Palmitoylation Detection Kitの幅広いアプリケーションデータをご紹介いたします。
※ ^RapidSPALM, Protein S-Palmitoylation Detection Kitの詳細はこちらをご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

表中の解析例をクリックすると、それぞれのアプリケーションデータをご覧になれます。
※ アプリケーションデータをご覧になられる前に、まずは「^RapidSPALMのデータの見方」をご確認下さい。

※ 蛍光アッセイの解析方法・データの見方はこちらをご確認下さい。

試料：成体マウスから摘出した脳、腎臓、脾臓、肝臓
ライセート調製方法：トータル組織ライセート
使用したキット：反応キット
スタート試料量：200 μg／1処理

試料：成体マウスから摘出した脳組織
ライセート調製方法：トータル組織ライセート
使用したキット：反応キット
スタート試料量：200 μg／処理
電気泳動条件：非還元条件（MfTag標識を維持）
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。
検出方法：銀染色および蛍光イメージャー検出（Ex 312 nm／Em ＞560 nm）

※ ゲルシフトアッセイの評価方法はこちらをご確認下さい。

試料：成体マウスから摘出した脳組織
ライセート調製方法：トータル組織ライセート
使用したキット：反応キット
スタート試料量：200 μg／処理
電気泳動条件：非還元条件（MfTag標識を維持）
※ ゲル濃度は、画像中それぞれの因子名の下のカッコ内をご参照下さい。
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。
検出方法：PVDFメンブレンに転写後、各種特異的抗体を用いてウエスタンブロットを実施

マウス脳組織ライセートに対して反応キットを用いて－/－、－/+、+/+の3種類の処理を行った。反応後、各処理試料をMfTagが維持されるよう非還元条件下にて各因子の分子量にあったゲル濃度でSDS-PAGEを実施し、PVDFメンブレンに転写した後、代表的なパルミトイル化タンパク質に対する特異的抗体を用いたウエスタンブロットで検出した。
いずれの因子においても+/+のみでバンドシフトが観察され、－/+ではバンドシフトが見られていないため、S-パルミトイル化修飾特異的な変換反応が確認できた。マウス脳組織においてHrasは2つ、GNAQは2つ、Flotillin-2は4つ、Fynは2つ、Calnexinは2つ、PSD95は2つのMfTag、すなわちS-パルミトイル基を有すると推定された。なお、GluN2Bは分子量約150 kDaで、+/+特異的にスメア状のバンドシフトが観察されたが、MfTagの標識個数の判定はできなかった。

※ 精製キットによる各種評価方法はこちらをご確認下さい。

試料：成体マウスから摘出した脳、腎臓、脾臓、肝臓
ライセート調製方法：トータル組織ライセート
使用したキット：反応キット＋精製キット
スタート試料量：200 μg／1処理
精製カラムにアプライしたタンパク質量：100 μg／1処理
電気泳動条件：還元条件（MfTag標識を除去）
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。

A：精製キットによるMfTag標識タンパク質の精製作業後、4種類の組織の+/+処理のカラム精製前試料（Input、10倍希釈）およびカラム溶出画分（Elution、原液）を同液量ずつ還元条件下で電気泳動し精製量を比較した。4種類の組織では脳組織で最も多く精製されていることがわかる。

B：精製キットによるMfTag標識タンパク質の精製作業後、4種類の組織それぞれの3処理（－/－、－/+、+/+）のカラム精製前試料（Input、20倍希釈）およびカラム溶出画分（Elution、原液）を同液量ずつ還元条件下で電気泳動し、銀染色で検出した。いずれの組織においても+/+特異的な精製タンパク質が多数観察された。
注：肝臓では、30kDa付近の一部のタンパク質が－/－でもカラム精製されているのが確認できる。このようなタンパク質はカラム吸着性のある非特異成分である。

試料：成体マウスから摘出した脳
ライセート調製方法：トータル組織ライセート
使用したキット：反応キット＋精製キット
スタート試料量：200 μg／1処理
精製カラムにアプライした量：100 μg／1処理
電気泳動条件：還元条件（MfTag標識を除去、図A、B、C-左）および非還元条件（MfTag標識を維持、図C-右）
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。

A：精製キットによるMfTag標識タンパク質の精製操作後、カラム精製前試料（Input、10倍希釈）、カラム素通画分（Flow through（FT）、10倍希釈）、カラム溶出画分（Elution、原液）を同液量ずつ還元条件下で電気泳動し、銀染色で検出した。総タンパク質量に差がみられない中、+/+ に特異的な精製タンパク質が多数検出された。

B：精製キットによるMfTag標識タンパク質の精製操作後、Input、FT、Elution（いずれも原液）を同液量ずつ還元条件下で電気泳動し、PVDFメンブレンへ転写した後、7種類の代表的なパルミトイル化タンパク質の各特異的抗体を用いてウェスタンブロットで検出を行った。各タンパク質のInput、FT、Elutionは同一メンブレン上で、データを取得した。いずれのタンパク質についても+/+特異的にElutionで検出された。

C：精製キットによるMfTag標識タンパク質の精製操作後、Input、FT、Elution（いずれも原液）を同液量ずつ還元条件下（左）、および非還元条件下（右）で電気泳動し、PVDFメンブレンへ転写した後、代表的なパルミトイル化タンパク質であるPSD95とCalnexinの特異的な抗体を用いてウェスタンブロットで検出を行った。まず、非還元条件（右）を見ると、PSD95、CalnexinともにMfTag標識済みのバンドはFTには見られず、Elutionのみ観察されたため、カラム精製が良好に完了していることがわかる。このようなケースにおいて、還元条件（左）でFTとElutionの存在量を比較することで、S-パルミトイル化修飾存在量を推察することができ、PSD95、Calnexinともに大部分がS-パルミトイル化体であることが推定された。

事前の試料調製：図Aに沿ってマウス脳組織からP2膜画分およびP2-Triton X100不溶性画分（P2-TXinsol）を取得した。
使用したキット：反応キット＋精製キット
分析方法：蛍光アッセイ、カラム精製溶出物の銀染色
スタート試料量：100 μg／1処理
精製カラムにアプライした量：50 μg／1処理
電気泳動条件：還元条件（MfTag標識を除去）
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。

A：P2およびP2-TXinsol画分の取得方法。マウス全脳を界面活性剤不含破砕バッファー（50 mM Phosphate (pH 7.4), 150 mM NaCl, 320 mM Sucrose）中にてダウンス型ホモジナイザーで破砕後、低速遠心分離にてP1画分を沈殿として除去した後、上清S1を中速遠心分離にかけた。沈殿をP2画分として回収し、さらにP2画分の半分に1% Triton X100バッファーを添加して可溶化後、中速遠心分離でTriton X100可溶性画分（P2-TXsol）と不溶性画分（P2-TXinsol）に分画した。回収したP2およびP2-TXinsol画分に1× Basal bufferを添加し可溶化して反応キットに使用した。

B：蛍光アッセイによる各試料のhpHA特異性の評価（上）および各試料間のパルミトイル化量の相対比較（下）。全脳組織に比べP2画分、P2-TXinsol画分でパルミトイル化タンパク質が濃縮しているのが確認できる。

C：精製キットによる精製作業後、各+/+のカラム精製前試料（Input、5倍希釈）およびカラム溶出画分（Elution、原液）を同液量ずつ還元条件下で電気泳動し、銀染色で検出した。精製されたタンパク質が全脳組織に比べP2画分、P2-TXinsol画分でパルミトイル化タンパク質が濃縮しているのが確認できる。

事前の試料調製：図Aに沿ってNeuro2a細胞からトータル細胞ライセート、P_10k画分（主に細胞膜）、S_10k画分（主に小胞体膜および細胞質）を取得した。
使用したキット：反応キット＋精製キット
分析方法：蛍光アッセイ、カラム精製溶出物の銀染色
スタート試料量：100 μg／1処理
精製カラムにアプライした量：50 μg／1処理
電気泳動条件：還元条件（MfTag標識を除去）
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。

A：Neuro2a由来各ライセートの調製方法。"Whole"はNeuro2aに直接1× Basalbufferを添加してライセートを調製した。一方、分画用として界面活性剤不含の破砕バッファー（50 mM Phosphate (pH7.4), 150 mM NaCl, 320 mM Sucrose）により細胞を懸濁後、超音波破砕を行い、中速遠心分離（10,000×g、20分間、4℃）により沈殿画分（P_10k）および上清画分（S_10k）を取得した。各試料のバッファーを統一するため、それぞれCMpptを一度実施し、いずれも1x Basal Bufferに置換した後、反応キットに使用した。

B：蛍光アッセイによる各試料のhpHA処理特異性の評価。

C：総タンパク質量の割合（左）と蛍光アッセイを基にした各試料のS-パルミトイル化修飾量の割合（右）。本分画実験ではS_10kにS-パルミトイル化タンパク質が相対的に多く含まれていた。

D：精製キットによる精製作業後、各+/+のカラム精製前試料（Input、20倍希釈）およびカラム溶出画分（Elution、原液）を同液量ずつ還元条件下で電気泳動し、銀染色で検出した。精製されたタンパク質がトータル細胞ライセートに比べS_10kにS-パルミトイル化タンパク質が濃縮しているのが確認できる。

事前の試料調製：図Aに沿ってNeuro2a細胞に4種類の薬剤（パルミトイル転移酵素（PAT）阻害物質（10 μM 2-Bromopalmitate + 10 μM Cerulenin）、一酸化窒素（NO）ストレス（1 mM SNAP）、小胞体（ER）ストレス（1 μg/ml Tunicamycine）および細胞膜脱分極（50 mM KCl））を24時間処理し、細胞を回収後、細胞膜粗精製画分（P_10k）を粗精製した。
使用したキット：反応キット＋精製キット
分析方法：蛍光アッセイ、カラム精製溶出物の銀染色
スタート試料量：100 μg／1処理
精製カラムにアプライした量：50 μg／1処理
電気泳動条件：還元条件（MfTag標識を除去）および非還元条件（MfTag標識を維持）
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。

A：実験プロトコルの概要

B：蛍光アッセイによる各+/+試料の蛍光値を測定後、コントロール処理の蛍光値に対する各刺激処理の蛍光値を比較した。いずれも蛍光量（＝S-パルミトイル化修飾総量）の変動が確認でき、特にNOストレスにおいて顕著な減少が確認された。

C：精製キットによる精製作業後、各+/+試料のカラム精製前試料（Input）とカラム溶出画分（Elution）を還元条件下および非還元条件下で電気泳動し、銀染色で検出した。いずれの条件下においてもNOストレス処理により精製タンパク質の大きな変動が観察された。

試料：成体マウスから摘出した脳組織
ライセート調製方法：トータル組織ライセート
使用したキット：反応キット＋精製キット
スタート試料量：200 μg／処理
精製カラムにアプライした量：各変換反応終了後の総タンパク質の半量相当
電気泳動条件：還元条件（MfTag（^RapidSPALMの場合）、biotin（ABE法の場合）をそれぞれ除去）
※ 非還元・還元条件の選択方法はこちらをご覧下さい。

A：比較実験プロトコル
ABE法は一般的なプロトコルを採用し、CMpptは計8回（ブロッキング後5回＋ビオチン標識後3回）実施した。^RapidSPALMはキットプロトコルを使用し、CMpptは計2回実施した。

B：それぞれ変換反応終了時の総タンパク質量の評価、銀染色（左）とBCAアッセイによる損失率の算定（右）
^RapidSPALMはCMppt回数の削減により総タンパク質の損失を抑えるとともに、電気泳動におけるスメア化が抑えられた。

C：各精製作業後の溶出画分の銀染色での検出
^RapidSPALMはABE法に比べ精製量が大幅に向上していることがわかる。量比のより正確な比較のため、^RapidSPALMは5倍希釈しABEと比較したところ、銀染色において同程度の染色強度が得られため、^RapidSPALMはABE法の5倍程度感度向上が見積もられた。