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GCリッチなDNA標的に作用しPCRの特異的な増幅効率をアップします BioStab PCR Optimizer

掲載日情報:2021/02/25 現在Webページ番号:67284

PCRの増幅効率と特異性を向上させる試薬です。5倍濃縮の液体で、PCRバッファー中に終濃度で1倍濃度(GC含有量が75%を超える場合は2倍濃度)となるように加えるだけでATペアには影響を与えず、目的配列のPCRの増幅効率を向上させます。アニーリング温度の選択の自由度が高くなるため、PCRの厳密なコンディション決めは不要となります。

※ 便利なBioStabシリーズには、抗体と⻄洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート安定化試薬もあります。

使用例

使用例1(GC含有量74%の試料のPCR、Mouse PKA Cβ fragment)

Mouse PKA Cβ fragmentのPCRを行った結果

マウスのプロテインキナーゼA(cAMP-dependent protein kinase A; PKA)の触媒サブユニットCβの、5'領域からの375 bpフラグメント(GC含有量74%)を標的にして、本使用例1に記載されているような何種類かのアニーリング温度を用いて検出を行った。
レーン2~4:本製品は、54~64℃と広い範囲のアニーリング温度で使用可能だった。増幅条件の厳密な最適化が不要であることが示された。
レーン5~7:本製品を加えずPCRを行った場合は、いずれも特異的バンド(オレンジ色の矢印の箇所)の増幅が見られなかった。
レーン1:分子量マーカーのDNAラダー。

使用例2(GC含有量75%の試料のPCR、Human Retinoblastoma gene)

Human Retinoblastoma geneのPCRを行った結果

ヒト網膜芽細胞腫遺伝子は、その5´末端にGC含有率75%の領域を含むため、PCR反応液に特別な添加剤を加えなければ増幅できない。PCRバッファーへの添加剤の有無それぞれで増幅した場合の結果を比較した。
レーン2:添加剤無しの通常のPCRバッファーの場合は、非特異的なバンドが複数出現した。
レーン3:終濃度1倍となるように本製品を添加した場合、期待されるバンド(180 bpフラグメント)の効率的な増幅が見られた。
レーン4~5:PCRバッファーに他社製品あるいは1 Mベタイン(Betaine)を添加した場合、180 bpのバンドが出現したが、同時に非特異的なバンドが上方に現れた。
レーン1:分子量マーカーのDNAラダー。

使用例3(GC含有量が75%を超える試料のPCR、Human genome DNA containing CGG triple nucleotide repeat)

Human genome DNA containing CGG triple nucleotide repeatのPCRを行った結果

GC含量が75%を超えるような標的の増幅には、本製品の添加量を増やす必要がある。GC含量が78.5%で、CGGのトリヌクレオチドリピートを含むヒトゲノムDNAの149 bpの領域を標的に選んで、PCRバッファーへの添加剤の有無それぞれで増幅した場合の結果を比較した。
レーン2:添加剤無しの通常のPCRバッファーの場合、複数の非特異的バンドが観察された。
レーン3:PCRバッファーに2倍濃度の本製品を添加した場合、期待される特異的バンドが得られた。
レーン4~5:PCRバッファーに他社製品または1 M ベタイン(Betaine)を添加した場合、期待されるバンドに加えて上方の非特異的なバンドも増幅された。
レーン1:分子量マーカーのDNAラダー。

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特長

  • PCRバッファー中に終濃度で1倍または2倍(高GC含有量の場合)となるように添加するだけです。
  • タンパク質成分や防腐剤は含まれていません。試薬成分を蒸留水で調製後、0.22μmフィルターでろ過されています。
  • GCリッチなDNA標的(>70%)の増幅に適しており、ATペアの増幅には影響を与えません。
  • 本製品の添加によりアニーリング温度の選択の自由度が高くなるため、PCRの厳密なコンディション決めが不要となります。

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PCRにおけるGCリッチな領域の増幅の重要性とは

ヒトゲノムのGC含量は40%強と報告されていますが1、プロモーター、エンハンサー、その他の制御因子を含む多くの重要な調節ドメインには、GCリッチな配列が存在してます2。また、このようなGCリッチな配列中には、分子内で二次構造を形成し増幅が困難なものもあります3。このため、GCリッチな配列の解析を容易にするために、これまでも様々な試みがなされてきました。例えば、ベタイン(Betain, (CH3)3N+CH2COO-4、DMSO(Dimethyl sulfoxide)5などを添加する手法が報告されていますが、本製品はこれらの試薬よりも良好な結果が得られます。

参考文献

  1. Piovesan A., et al., BMC Res. Notes, 12, 106 (2019). [PMID: 30813969].
  2. Hapgood, J.P., et al., Cell Biol. Int., 25(1), 17~31 (2001). [PMID: 11237405]. (Review)
  3. McDowell D.G., et al., Nucleic Acids Res., 26(14), 3340~3347 (1998). [PMID: 9649616].
  4. Henke W., et al., Nucleic Acids Res., 25(19), 3957~3958 (1997). [PMID: 9380524].
  5. Winshop P.R., Nucleic Acids Res., 17(3):1266 (1989). [PMID: PMID: 2922271].


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