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TR-FRET法によりE3酵素における自己ユビキチン化をリアルタイムに測定するキット E3 Ligase TR-FRET Ubiquitination Kit

掲載日情報：2020/06/12 現在Webページ番号：66035

サウスベイバイオ /
South Bay Bio, LLC
[メーカー略称：SBB]

ユビキチンリガーゼE3酵素の自己ユビキチン化をTR-FRETによりリアルタイムに測定できるアッセイキットです。
従来のウェスタンブロット法による検出系に比べ、簡便かつハイスループットな解析が可能で、E3酵素の作用機序の解析や、E3酵素の自己ユビキチン化の促進／阻害物質の探索スクリーニングに有用です。

※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

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ユビキチンプロテアソームシステム (UPS)とユビキチン修飾

細胞内のタンパク質のホメオスタシスは、タンパク質新生、翻訳後修飾およびタンパク質分解によって厳密に制御されています。タンパク質の分解は、（1）損傷したタンパク質・不要なタンパク質の除去、（2）部分分解によるタンパク質の活性化、（3）機能制御のための完全分解などに寄与しています。哺乳動物においてタンパク質の80％以上は、ユビキチン－プロテアソームシステム（Ubiquitin-proteasome system：UPS）によって分解されることが知られており、過去10年でUPSについての研究が著しく進んでいます。近年、タンパク質のユビキチン修飾は単にタンパク質の分解だけでなく、さまざまなタンパク質機能制御（例えば、遺伝子発現制御、転写因子の活性化、リン酸化酵素の活性化、DNA修復、エンドサイトーシスの制御など）に関与することが明らかになってきており、UPSの制御メカニズムの解明が期待されています。

「タンパク質のユビキチン化」は、76アミノ酸からなる小さなタンパク質“ユビキチン”（およびSUMO、ISG15、NEDD8などのユビキチン様タンパク質）が基質タンパク質に付加する可逆的な翻訳後修飾です。ユビキチン化反応は3つの酵素（E1酵素、E2酵素、E3酵素）により段階的に触媒されます。
E1酵素（ユビキチン活性化酵素）は、ATP依存的にユビキチンをE2酵素に受け渡す酵素で、1種類存在します。E2酵素（ユビキチン結合酵素）はE1酵素からユビキチンを受け取りE3酵素に受け渡す酵素で、現在35～40程度同定・解析が進められています。E3酵素（ユビキチンリガーゼ）は基質タンパク質にユビキチンを最終的に移す酵素です。E3酵素は700種以上存在するとされており、E3酵素の多様性が幅広い基質タンパク質のユビキチン化を可能にすると考えられています。これらユビキチン化修飾酵素群は、がんや神経疾患などにおいても重要であることが示唆されており、特にE3酵素の機能解析や阻害物質の取得が期待されています。
一方、DUB（脱ユビキチン化酵素）はユビキチン化タンパク質からユビキチンを除去する働きを担っています。DUBはUPSによるタンパク質分解の制御因子として不可欠な存在です。DUBは現在100種類以上あると推定されており、多くの研究からDUBの機能が疾患に関与していることが示唆されており、DUBの阻害物質探索が注目されています。





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測定原理

Real-Time TR-FRET Ubiquitin Assay Kit　#SBB-KF0036の測定原理

E3酵素の自己ユビキチン化レベルは、E3酵素の基質タンパク質に対するユビキチンリガーゼ活性を反映すると考えられており、従来法では抗ユビキチン化抗体を用いたウェスタンブロットにより、E3酵素の自己ユビキチン化レベルを定量します。
E3 Ligase TR-FRET Ubiquitination Kitは、独自のTR-FRETシステム（次項参照）で測定を行います。そのため、ウエスタンブロットなど煩雑な操作なしにE3酵素の自己ユビキチン化レベルをリアルタイムで観察することが可能となります。
同社のTR-FRETシステムでは、FRETドナーにEu3＋Ubiquitin、FRETアクセプターにCy5を採用しています。キットにはユビキチンにFRETドナーもしくはFRETアクセプターを標識したものと、未標識ユビキチンの混合物が含まれており、ユビキチン化反応が進行してポリユビキチン鎖が形成されるとFRET（励起 304 nm／蛍光 donor 620 nm, acceptor 665 nm）が誘導されます。
従来、ロースループットな解析がメインであったE3酵素の活性測定が、簡便かつハイスループットに実施できるため、E3酵素の自己ユビキチン化反応の作用機序の解析や、自己ユビキチン化の促進／阻害物質のスクリーニングに有用です。

■South Bay Bio社のTR-FRETシステムについて

SBB社のTR-FRETシステム

South Bay Bio社はEu3＋-CryptateをFRETドナー、Cy5をFRETアクセプターとして採用しています。Eu3＋-CryptateとCy5は蛍光スペクトルが重ならないため、理想的なFRETペアです。
Eu3＋-Cryptateは安定かつ蛍光寿命が長いため、TR-FRETに最適です。
TR-FRETにより非特異的な蛍光を排除できるため、高感度な検出が可能となります。

■South Bay Bio社のTR-FRETとほかのアッセイとの比較
手法精度
（Z'-factor）		フレキシビリティ生理学的
関連性		コスト
TR-FRET
(本製品)		リアルタイム高い
(Z'＞0.8)		高い高い低い
TR-FRET
(他社製品)		エンドポイント高い中低い高い
蛍光強度
(Ub-Rh110)		リアルタイム高い低い中低い
ELISAエンドポイント低い高い中低い
AlphaScreenエンドポイント高い高い中高い

■Eu3＋-Cryptateについて

レアアースであるEu3＋を用いた金属錯体型のFRETドナーはいくつか提案されていますが、安定性の問題や共存物により大きく影響を受ける問題がありました。
Cryptateは3つのbipyridineによるmacrocylical構造でEu3＋の全ての配位座を埋めることができるため、Eu3＋-Cryptateは既存のEu3＋錯体に比べて、極めて高い安定性を示し、EDTAなどの強力なキレート剤、共存2価イオンやpHなどアッセイバッファーの影響を受けません。そのため、Mg2＋を必要とするユビキチン化反応において問題なく使用できます。		 Eu3＋-Cryptateについて
CryptateChelate
Stabilityhighlow
Uncoordinated solvent bonds01～3
EDTA / EGTA Resistantyesno
Divalent Cation Tolerantyesno
Extreme pHyesno
High Organic Solventyesno
High Temperatureyesno

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特長

  • 独自のTR-FRETシステムにより、E3酵素の自己ユビキチン化レベルを高感度に検出できます。
  • 高いZ’factor (Z’＞0.8)を示すため、ハイスループットスクリーニングの構築に最適です。
  • オールインワンキットで、別途必要となる試薬はありません。
  • 簡単な操作でアッセイを実施できます。
  • 測定波長：励起 304nm／蛍光 620 nm（ドナー）、665 nm（アクセプター）
  • 推奨蛍光プレートリーダー：Molecular Devices M5e、PerkinElmer EnVision

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キット内容

キットには400反応分の試薬が含まれています。
オールインワンキットのため、別途必要となる試薬はありません。

  • E1 enzyme (UBA1)
  • E2 enzyme＊
  • E3 enzyme＊
  • Trf-Ubiquitin mix (Eu3＋-Cyptate-Ub, Cy5-Ub mixture)
  • Reaction buffer
  • Mg-ATP

※別途、Low volume plate（20μl対応）が必要です。
＊キットにより酵素の種類が異なります。

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使用例

MDM2を使ったユビキチンアッセイ

MDM2 E3 Ligase TR-FRET Kitを用いてMDM2の自己ユビキチン化レベルを観察した。
左：TR-FRETの測定結果
MDM2濃度（12.5 nM～200 nM）に依存した自己ユビキチン化が観察された。
右：Z’factor
いずれのMDM2濃度においても30～45分程度でZ’＞0.8に達している


ITCHを使ったユビキチンアッセイ

ITCH E3 Ligase TR-FRET Kitを用いてITCHの自己ユビキチン化レベルを観察した。
左：TR-FRETの測定結果
ITCH濃度（8.125 nM～130 nM）に依存した自己ユビキチン化が観察された。
右：Z’factor
いずれのITCH濃度においても120分程度でZ’＞0.8に達していた。特に65 nM以上では45分程度でZ’＞0.8を満たしていた。

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製品ラインナップ

ファミリーE3リガーゼE1酵素E2酵素商品コード
RINGMDM2UBA1UBE2D3SBB-KF0030
RINGXIAPUBA1UBE2D3SBB-KF0057
RBRParkinUBA1UBE2D3SBB-KF0036
HECTITCHUBA1UBE2L3SBB-KF0035
HECTNEDD4UBA1UBE2L3SBB-KF0056


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価格

[在庫・価格 ：2025年04月25日 18時55分現在]

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MDM2 E3 Ligase TR-FRET Kit
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ユビキチンE3リガーゼであるMDM2のオートユビキチン化活性をリアルタイムで検出できるアッセイキットです。本製品にはE1酵素（UBA1)、E2酵素（UBE2D3)、E3酵素（GST-MDM2）およびTR-FRET用のユビキチンミックスおよびアッセイバッファーがオールインワンで含まれています。（1 kit 400アッセイ分）。
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保存条件 -80℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2019年9月1日号 p.9
ニュース2018年3月15日号 p.26

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ユビキチンE3リガーゼであるITCHのオートユビキチン化活性をリアルタイムで検出できるアッセイキットです。本製品にはE1酵素（UBA1)、E2酵素（UBE2D3)、E3酵素（ITCH）およびTR-FRET用のユビキチンミックスおよびアッセイバッファーがオールインワンで含まれています。（1 kit 400アッセイ分）。
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ユビキチンE3リガーゼであるParkinのオートユビキチン化活性をリアルタイムで検出できるアッセイキットです。本製品にはE1酵素（UBA1)、E2酵素（UBE2D3)、E3酵素（Parkin）およびTR-FRET用のユビキチンミックスおよびアッセイバッファーがオールインワンで含まれています。（1 kit 400アッセイ分）。
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[在庫・価格 ：2025年04月25日 18時55分現在]

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MDM2 E3 Ligase TR-FRET Kit

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説明文 ユビキチンE3リガーゼであるMDM2のオートユビキチン化活性をリアルタイムで検出できるアッセイキットです。本製品にはE1酵素（UBA1)、E2酵素（UBE2D3)、E3酵素（GST-MDM2）およびTR-FRET用のユビキチンミックスおよびアッセイバッファーがオールインワンで含まれています。（1 kit 400アッセイ分）。
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法規制等 カルタヘナ該当品
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NEDD4 E3 Ligase TR-FRET Kit

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関連製品

下記製品を組み合わせることで、任意のE3リガーゼに対するTR-FRETアッセイを構築することができます。
ご自身でアッセイを構築される場合、E3酵素に適した条件検討が必要になります。

TR-FRET-Ubiquitin Mix ＋ E1酵素 ＋ E2酵素 ＋ 任意のE3酵素
※別途、Mg-ATPが必要です。


必要なコンポーネント製品名商品コード
ユビキチンミックスTR-FRET-Ubiquitin MixSBB-TR0051-2K
E1酵素UBA1SBB-CE0011
E2酵素UbcH5c/UBE2D3SBB-CE0019
UbcH7/UBE2L3SBB-CE0020
UbcH5a/UBE2D1SBB-CE0021
UbcH1/UBE2K/E2-25KSBB-CE0022
UBE2D2SBB-CE0027
E3酵素任意のE3をご用意下さい。
※E3酵素はUbiquigent社にて取り扱っています。

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お問い合わせ先

（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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ユビキチン化・SUMO化