miRNA mimic合成サービス

（株）ジーンデザインのmiRNA mimicは、天然型RNAから成るガイド鎖と、化学修飾したパッセンジャー鎖で構成されています。ガイド鎖は強いRNAi活性を示し、パッセンジャー鎖はRNAi活性を示さないため、成熟miRNAそのものの活性を見ることができます。

※ 本製品は、(株)ジーンデザインと(株)サイトパスファインダーの共同研究により得られた成果を基に製品化しております。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

■miRNA mimic 合成法の選択

1．ガイド鎖のみRNAi活性を発揮する配列修飾の選択

ガイド鎖を天然RNA、パッセンジャー鎖に科学修飾を施した二本鎖RNAを複数合成した。レポーターアッセイを実施し、miRNA mimicとしての機能を調べた。二本鎖とも天然RNAであるものやいくつかの合成法では、ガイド鎖、パッセンジャー鎖ともにRNAi活性を示していた(図1.#7-#10)。ガイド鎖が強いRNAi活性を示し、パッセンジャー鎖がRNAi活性を示さないことを指標にmiRNA mimic修飾を選択した。

図1.レポーター遺伝子の 3’-UTRにmiRNAのガイド鎖の標的となる配列(Fw target)、パッセンジャー鎖の標的となる配列(Rv target)、もしくは,標的となる配列がない(without target)プラスミドを用い、レポーターアッセイを実施した。ここでは、一例としてmiR-1 mimicに対するアッセイ結果を示している。ガイド鎖のRNAi活性が高いmiRNA mimicを左から並べている。

2．miRNA mimicによるRNAi活性の配列修飾の選択

1.で修飾方法を選択した、miR-1, miR-135 mimicについて濃度を変えて固相トランスフェクション方にてHeLa細胞に導入したところ、濃度依存的にRNAi活性を示した(図2a)。通常のリポソームトランスフェクション法では、0.5 nmという低濃度においてもRNAi活性を確認できた（図2b）。

図2. a) miRNA mimic を濃度を変えて固相トランスフェクション方によりHeLa細胞に導入し、レポーターアッセイを実施した。B)0.5 nM miRNA mimicをリポソーム方によりHeLa細胞に導入し、レポーターアッセイを実施した。

■miRNA mimic導入による細胞生存への影響（ミニスクリーニング）

32種のmiRNA mimicsについて、細胞生存への影響を調べた(図3)。固相トランスフェクションプレートに細胞を播種することによりmiRNA mimicを導入した（図3a）。細胞死を引き起こすsiRNAをコントロールとして用いることで、トランスフェクション条件を決定した。A549細胞では、1％FBS存在下にて培養した場合にmiR-199a-5p、miR-200c-3p、miR-16-5pが生存率を低下させた。これまでに報告されているmiRNAが含まれており、選択した合成法が有効であることを示していると考えられる。

図3 .miRA mimicのA549細胞の生存率への影響を調べた。固相トランスフェクション(a)により、miRNA mimicを導入後、1% FBS存在下で培養した(b)。

アッセイ実施機関：株式会社サイトパスファインダー

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