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大腸菌ゲノムのコンタミネーションが検出限界以下のPfu DNAポリメラーゼ Pfu DNA polymerase, UltraPure

掲載日情報:2013/10/03 現在Webページ番号:8058

高いFidelity(正確性)を必要とするPCR反応に広く使用されているPfu DNA polymeraseは,Pyrococcus furiosus由来の耐熱性DNA polymeraseです。 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性による高い校正活性を有しています。
しかし,PCR酵素のFidelityは,バッファー条件によって容易に変動することが知られています。本製品のPfu DNA polymeraseは,各ロット毎に添付の反応BufferとdNTPを用いてFidelityを検定し,Taq DNA polymeraseの10倍以上であることを確認しています。
また,PCR酵素へのホスト大腸菌ゲノムのコンタミネーションが,しばしば実験を混乱させる要因になることが報告されています。本製品は高度に精製されており,発現宿主である大腸菌ゲノムDNAは検出されません。

Pfu DNAポリメラーゼ(Pfu DNA Polymerase)の特長

  • 高いをFidelityを要求するPCR反応に適しています。
  • 添付の酵素と10 × Reaction Buffer,dNTPの組み合わせで各ロット毎のPCR反応における増幅能を確認しています(図1参照)。
  • ホストである大腸菌ゲノムのコンタミネーションは,現在のBioDynamics Laboratory社の検定基準の下限値である0.05分子/unit未満を保証しています(図2及び図3参照)。
大腸菌ゲノムのコンタミネーションが検出限界以下のPfu DNAポリメラーゼ Pfu DNA polymerase, UltraPure

図1: 本製品を用いて,λDNAを鋳型として種々のサイズのDNA断片を増幅した結果
0.8%アガロースゲル電気泳動。分子量マーカーは,Dynamaker DNA High D (#DM112)

大腸菌ゲノムのコンタミネーションが検出限界以下のPfu DNAポリメラーゼ Pfu DNA polymerase, UltraPure

図2: 本製品とA社製品のDNA polymerase中の大腸菌ゲノムのコンタミネーションの比較
各1 unit酵素中の大腸菌16S rRNA領域を40サイクルの高感度のPCR反応にて増幅した結果。矢印は大腸菌16S rRNA領域からの増幅断片(366 bp)の位置を示す。A社製品のPfu DNA polymeraseとすべてのPfu関連製品から,大腸菌ゲノムが検出されていることがわかる。”Native”はPyrococcus furiosusより精製されたものであるが,検出された増幅断片をTAクローニングし,シークエンスを行った結果,Pyrococcus由来ではなく大腸菌由来のrRNAであることが確認された。精製過程で汚染されたものと思われる。
3.5%アガロースゲル電気泳動。分子量マーカーは,DynaMarker DNA Low D (#DM112)

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大腸菌ゲノムのコンタミネーション検定法

各製品ロット毎のコンタミネーションを,direct PCR法により高感度に検定しています。このアッセイ法では,大腸菌ゲノムを1分子まで検出可能です。
大腸菌ゲノムのコンタミネーションが検出限界以下のPfu DNAポリメラーゼ Pfu DNA polymerase, UltraPure

図3: 大腸菌ゲノムのコンタミネーションの検定

1 unitのPfu DNA polymeraseに,外部から量の異なる大腸菌ゲノム(0分子~1分子)を添加し,大腸菌16S rRNA領域検出用プライマーを用いて40 サイクルの direct PCRを行った。矢印で示した位置に,大腸菌16S rRNA領域由来のバンド(366 bp)が検出された。外部から添加した大腸菌ゲノムの平均分子数は,0分子~1分子と少ないことから各チューブの中にゲノムが存在する確率(0分子, 1分子, 2分子, 3分子…)は,ポアソン分布に従っている。40バッチ中何個のバッチで大腸菌ゲノムが検出されるかは,理論値として右端に示している。実際の実測値は,右から2列目に示している。これら実測値は,理論値に近く,本方法で1分子の大腸菌ゲノムが,検出できていることを示している。また,外部から大腸菌ゲノムを添加していない場合では,40バッチの検定でもバンドが検出されていない。このことから,大腸菌ゲノムのコンタミネーションは,1 unitあたり0.05分子未満(理論値1.95バッチ未満)であることがわかる。

[在庫・価格 :2018年04月20日 18時20分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名 商品コード メーカー 包装 価格 在庫 納期 文献数 リスト
Pfu DNA Polymerase, UltraPure (with dNTP)
データシート
DE131 BDLバイオダイナミクス
BioDynamics Laboratory Inc.(株式会社バイオダイナミクス研究所)
1 set ¥6,200 1個 - 0 追加

説明文 大腸菌ゲノムのコンタミネーションが検出限界以下のPfu DNA ポリメラーゼ(Pfu DNA Polymerase)。セット内容:Pfu DNA polymerase (2.5 units/μl) 100 units, 10×Reaction Buffer 1000μl
法規制等
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BioDynamics Laboratory Inc.(株式会社バイオダイナミクス研究所)
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Pfu DNA Polymerase, UltraPure (with dNTP)

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  • 商品コード:DE130
  • メーカー:BDL
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詳細 商品名 商品コード メーカー 包装 価格 在庫 納期 文献数 リスト
DynaMarker, DNA Low D
データシート
DM112 BDLバイオダイナミクス
BioDynamics Laboratory Inc.(株式会社バイオダイナミクス研究所)
1 set ¥15,000 3個以上 - 0 追加

説明文 DNA分子量ラダーマーカー(DNA Ladder Marker)。Ready-to-LoadのDNA分子量マーカー。50~1,000 bp。6×BPB loading dye(1 ml)添付。容量:1 ml(5~10μl/lane)。容量:1 ml(5~10μl/lane)
法規制等
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ニュース2017年2月15日号 p.12

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DynaMarker, DNA Low D

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  • 商品コード:DM112
  • メーカー:BDL
  • 包装:1set
  • 価格: ¥15,000
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説明文 DNA分子量ラダーマーカー(DNA Ladder Marker)。Ready-to-LoadのDNA分子量マーカー。50~1,000 bp。6×BPB loading dye(1 ml)添付。容量:1 ml(5~10μl/lane)。容量:1 ml(5~10μl/lane)
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