大腸菌ゲノムのコンタミネーションが検出限界以下のPfu DNAポリメラーゼ Pfu DNA polymerase, UltraPure

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

高いFidelity(正確性)を必要とするPCR反応に広く使用されているPfu DNA polymeraseは，Pyrococcus furiosus由来の耐熱性DNA polymeraseです。 3'→5'エキソヌクレアーゼ活性による高い校正活性を有しています。
しかし，PCR酵素のFidelityは，バッファー条件によって容易に変動することが知られています。本製品のPfu DNA polymeraseは，各ロット毎に添付の反応BufferとdNTPを用いてFidelityを検定し，Taq DNA polymeraseの10倍以上であることを確認しています。
また，PCR酵素へのホスト大腸菌ゲノムのコンタミネーションが，しばしば実験を混乱させる要因になることが報告されています。本製品は高度に精製されており，発現宿主である大腸菌ゲノムDNAは検出されません。

図1：　本製品を用いて，λDNAを鋳型として種々のサイズのDNA断片を増幅した結果
0.8％アガロースゲル電気泳動。分子量マーカーは，Dynamaker DNA High D　(#DM112)

図2：　本製品とA社製品のDNA polymerase中の大腸菌ゲノムのコンタミネーションの比較
各1 unit酵素中の大腸菌16S rRNA領域を40サイクルの高感度のPCR反応にて増幅した結果。矢印は大腸菌16S rRNA領域からの増幅断片（366 bp）の位置を示す。A社製品のPfu DNA polymeraseとすべてのPfu関連製品から，大腸菌ゲノムが検出されていることがわかる。”Native”はPyrococcus furiosusより精製されたものであるが，検出された増幅断片をTAクローニングし，シークエンスを行った結果，Pyrococcus由来ではなく大腸菌由来のrRNAであることが確認された。精製過程で汚染されたものと思われる。
3.5％アガロースゲル電気泳動。分子量マーカーは，DynaMarker DNA Low D　(#DM112)

図3：　大腸菌ゲノムのコンタミネーションの検定

1 unitのPfu DNA polymeraseに，外部から量の異なる大腸菌ゲノム（0分子～1分子）を添加し，大腸菌16S rRNA領域検出用プライマーを用いて40 サイクルの direct PCRを行った。矢印で示した位置に，大腸菌16S rRNA領域由来のバンド（366 bp）が検出された。外部から添加した大腸菌ゲノムの平均分子数は，0分子～1分子と少ないことから各チューブの中にゲノムが存在する確率（0分子, 1分子, 2分子, 3分子…）は，ポアソン分布に従っている。40バッチ中何個のバッチで大腸菌ゲノムが検出されるかは，理論値として右端に示している。実際の実測値は，右から2列目に示している。これら実測値は，理論値に近く，本方法で1分子の大腸菌ゲノムが，検出できていることを示している。また，外部から大腸菌ゲノムを添加していない場合では，40バッチの検定でもバンドが検出されていない。このことから，大腸菌ゲノムのコンタミネーションは，1 unitあたり0.05分子未満（理論値1.95バッチ未満）であることがわかる。

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