PromoCell社 凍結細胞の融解～継代培養の方法について
掲載日情報：2022/06/23 現在Webページ番号：80569
凍結細胞の融解から継代培養までのワークフローについて、操作方法と注意事項をまとめました。
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凍結細胞の融解～継代培養のワークフロー目次
各ステップをクリックすると、それぞれの操作方法概略をご覧いただけます。
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凍結細胞の融解と培養
1. 培地の調製
- ☞ 推奨播種密度を参考に、必要な培養面積を算出する。
- PromoCell社の培地を培養フラスコに適量（細胞1 vial につき9 ml以上）入れる。
- インキュベーター（37℃, 5％ CO2）内に30分間静置する。
推奨播種密度の計算方法
推奨播種密度 = バイアル中の生細胞数（cells/vial）*1 播種密度（cells/cm2）*2
＊1 製品のCoAをご確認下さい。
＊2 製品データシートをご参照下さい。
計算例
| Cell type | Recommended media |
Plating dencity cells/cm2 |
Passage after thawing |
Tested Marker | PDs |
|---|---|---|---|---|---|
| HCH-Human chondrocytes |
C-27101 | 10,000～20,000 | P2 | Differentiation tested |
＞10 |
500,000（cells/vial） 10,000（cells/cm2） = 50 cm2
この場合、合計50 cm2なので、T25フラスコ×2本（各9 ml培地を含む）を準備する。
凍結細胞の融解～継代培養のワークフロー目次へ戻る2. 細胞の融解
- バイアルを液体窒素コンテナから取り出し、直ちにドライアイス上に置く。
- コンテナとドライアイスの位置は極力近づける。バイアルを37℃のウォーターバスに浸し、約2分間穏やかに振とうして撹拌する。
重要事項
- バイアル内の液体窒素の除去と内圧を下げるために、層流型クリーンベンチ内で凍結バイアルのフタをいったん1/4回転ほど緩めて、再度締めて下さい。
- 融解前の細胞はドライアイス上に置いて輸送して下さい。
- バイアル内のいくらかの細胞は死滅していることに留意して、製品データシートに記載されている播種密度に従って下さい。
- 通常、細胞融解後に遠心分離を行うことは、培地中に希釈したDMSOが残存することよりも細胞にとって有害です。
- 細胞が接着して2～4時間後、または融解後翌日に培地の交換を行って下さい。
動画で見るヒト初代培養凍結細胞の融解方法
一般的な注意事項
凍結融解操作は細胞にストレスを与えます。凍結培地は凍結保護剤として細胞毒性を有するDMSOを含んでおり、培地中のDMSO濃度を1％以下に下げる必要があります。健全な増殖細胞を得るために、以下の点にもご留意下さい。
- 細胞は液体窒素から取り出した後、できるだけ早く37℃のウォーターバスに浸して融解して下さい。
- 液体窒素から細胞を取り出す前に、すべての準備を行って下さい。
- 融解後はDMSO含有凍結培地をできるだけ早く希釈して下さい。
- 遠心分離を行わないで下さい。
- 過剰なピペッティングや混合操作は避けて下さい。
ヒト初代培養凍結細胞の融解方法（〇良い例）
ヒト凍結細胞の融解方法の🅧悪い例
※ 以下に示すような方法による凍結細胞の融解は、絶対に行わないで下さい。
3. バイアルの消毒と細胞播種
コンタミネーションを防止するため、バイアル自体を70％エタノールで消毒する。エタノールをふき取り、層流型クリーンベンチ内でバイアルのふたを開ける。バイアル内の細胞を、慎重にピペットで再懸濁する。ステップ 1で準備したフラスコ内に細胞を移す。
4. インキュベーション
- フラスコをインキュベーター（37℃, 5％ CO2）内に静置し、細胞を接着させる。
- 16～24 時間後に培地を交換する。
- 細胞がコンフルエント（70～90％）に達した後、継代培養を行う。
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細胞の継代培養方法
細胞の継代培養のワークフロー
5. 試薬の調製および細胞の洗浄
- PromoCell社の☞ DetachKitを少なくとも30分間室温に置く。
- 培養フラスコから慎重に培地を吸引する。
- 培養フラスコ表面にHepes BSS*3を100 μl/cm2加え、15秒間穏やかに振とうして細胞を洗浄する。
6. 細胞の剥離
- 培養フラスコからHepes BSSを慎重に吸引する。
- トリプシン／EDTA溶液*3を100μl/cm2加える。
- 蓋を閉め、顕微鏡で細胞を観察する。
- 細胞が剥離し始めたら、培養フラスコの側面を軽く叩いて残っている細胞も剥離させる。
※細胞の剥離は室温で行うことをお勧めします。
7. トリプシンの中和と細胞の播種
- 培養フラスコ表面にTrypsin Neutralization Solution*3を100μl/cm2加え、穏やかに振とうする。
- 細胞懸濁液を慎重に吸引し、遠心チューブに移す。
- 220×gで3分間遠心し、細胞を沈殿させる。
8. 細胞のインキュベーション
- 上清を捨て、適切なPromoCell Growth Mediumを1 ml加える。
- ピペッティングにより、細胞を慎重に再懸濁する。
- 新しい培養フラスコに37℃に温めたPromoCell Growth Mediumを入れる。
- 推奨播種濃度に従って、新しい培養フラスコに細胞を播種する。
- 培養フラスコをインキュベーター（37℃、5％CO2）内に置く。
＊3印の試薬は☞ DetachKitに含まれています。
関連製品
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PromoCell_Best-Practices-in-Cell-Culture
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