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MP-Biomedicals （Q-Biogene）社 プラスミドDNA分離・ 精製キット RPM Kitに関するFAQ
掲載日情報：2017/09/01 現在Webページ番号：80552
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MP-Biomedicals （Q-Biogene）社 プラスミド DNA 分離・精製キット RPM Kitに関するFAQ
Q-1. Q･BIOgene 社 の RPM Kit のラインナップを教えて下さい。
A-1. ◆RPM Kit ( 商品コード：2070-200 ), RPM AFS Kit ( 商品コード：2072-200 )
シリカマトリックス Glassmilk を利用して、二本鎖プラスミドおよびファージ DNA を迅速に分離精製するキット。
◆RPM Spin Midi Kit ( 商品コード：2005-200 )
シリカマトリックス Glassmilk を用い、高純度プラスミド DNA 50 ～ 150 μg を、１時間以内で調製できるキット
◆RPM 1G Kit ( 商品コード：2077-200 )
シリカマトリックス Glassmilk を用い、250 ml の菌体から、0.5 ～ 1 mg のプラスミド DNA を、１時間で調製できるキット
◆RPM 4G Mini Monster Prep Kit ( 商品コード：2078-200 ), RPM 12G Monster Prep Kit ( 商品コード：2079-200 )
シリカマトリックス Glassmilk を用い、大量のプラスミドを調製するためのキット
Q-2. 私の使用している菌体は Alkaline Lysis Solution で完全に溶解しません。なぜでしょうか
A-2. Alkaline lysis solution 中の界面活性剤が沈殿していませんか。
Alkaline lysis solution ( RPM 4 G / 12 G キットに含まれる ALS II ) ）は 15 ℃以下で保存すると、溶液中の界面活性剤が沈殿して濃度が低下することがあるため,菌体の溶解性が乏しくなることがあります。もし沈殿を生じたら、60 ℃に温め、界面活性剤が再溶解するまで撹拌して下さい。
培養液中の菌体数は容量や培地、通気、宿主菌株、抗生物質濃度など様々な要因により変動します。菌体数が多すぎると、lysis solution の量が不十分である可能性があります。もしペレットの重量がプロトコルで推奨している値より多い場合は、培養液を薄めるか、または Pre - lysis、Alkaline lysis、Neutralizing solution の量をペレットの量に比例して増量して下さい。 Glassmilk とのバインディングステップでは、Pre - Lysis ＋ Alkaline lysis ＋ Neutralizing solution と等量になるように、5.5 M の guanidine thiocyanate を Glassmilk spinbuffer* ( あるいは RPM XG** Glassmilk ) に加えます。
* RPM Kit（ 商品コード：2070-200 他 ）に含有
** 1 G / 4 G / 12 G を示す
Q-3. 一晩培養した菌を用いて RPM Kit を使うと収量はどの様な要因に影響を受けますか?
A-3. 菌を増殖させるとき、プラスミドの選択・維持を継続することが重要です。培養時間が長くなることにより、抗生物質濃度が低下したり、抗菌力が失われると、プラスミドを欠く菌も増殖可能になります。これらの菌はプラスミドを有する菌よりも早い速度で増殖できるため、大量のペレットを得たとしてもごくわずかのプラスミドしか得ることができません。
また、効率のよい増殖のためには至適条件 ( 培養温度や通気など ) を継続することが必要です。
Q-4. RNA がコンタミした場合, どの様な原因が考えられますか。また, RNA の除去方法は？
A-4. ※RPM 4 G および 12 G キットのみ
二つの可能性が考えられます。
-
RNase による消化が不十分なため RNA がコンタミしたと思われます。
High Copy Protocol を使用している場合、溶菌前処理の段階で 20 ～ 50 μl の RNase Mixx を余分に加え、インキュベーション時間を増やします。または、中和反応後の透明なライセートに,更に RNase Mixx を加えて 55 ℃ ( ウォーターバス ) で 15 ～ 30 分インキュベートして下さい。 -
Modified”High Copy / Low Copy Protocol を用いて実験する際に、LiCl を添加しても RNA が沈殿しないことがあります。
この場合、LiCl 添加後、遠心操作の前に 15 分間氷上放置して下さい ( 4 G キットのみ ) 。
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