細胞内遊離ヘムを蛍光検出する試薬 HemeGREEN™＜Intracellular Labile Heme Detection Reagent＞

HemeGREEN™は生細胞内の遊離ヘム（Labile Heme）を観察できる蛍光プローブです。二価鉄（Fe²⁺）など他の活性種やタンパク質に内包されるヘムにはほとんど応答せず、遊離ヘムを選択的に検出することができます。
※ 本製品は岐阜薬科大学 平山祐教授の研究成果をもとに、フナコシ（株）が製品化し、販売しています。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

HemeGREEN™の製品イメージ

HemeGREEN™は蛍光色素Rhodolに細胞膜透過性を高めるためのアセチル基と、遊離ヘム応答部位が結合した構造を有しており、そのままではほとんど蛍光を発しません。HemeGREEN™は細胞培地に添加するだけで細胞内に取り込まれ、細胞内エステラーゼによってアセチル基が脱保護されることで「脱アセチル化HemeGREEN™」に変換されます。さらに周囲に遊離ヘムが存在する場合は、遊離ヘムが遊離ヘム応答部位と反応することによって、最大蛍光波長535 nmの緑色蛍光を発するようになります。これによって細胞内の遊離ヘムを蛍光シグナルによって可視化できます。
※ HemeGREEN™は生細胞専用にデザインされており、in vitroアッセイには使用できません。

※ HemeGREEN™の最適濃度や添加後の培養時間は、ご使用の細胞などにより適宜ご検討下さい。
※ 長時間放置すると細胞から蛍光色素の拡散が生じます。細胞洗浄後は、速やかに観察を行うことを推奨します。

HeLa細胞にヘムの原料である5-aminolevulinic acid（ALA、1 mM）、およびクエン酸鉄アンモニウム（FAC、10 μM）を添加した。原料の添加と同時に、ALAをヘム前駆体に変換する酵素ALA dehydrataseの阻害剤Succinylacetone（SA、1 mM）、さらにヘムの分解酵素Heme oxygenase-1の阻害剤ZnPPIX（1 μM）を添加し、一晩培養した。その後、HemeGREEN™で細胞を30分間処理し、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光像を観察することで、これら添加物が細胞内遊離ヘム濃度に与える効果を評価した。ALAおよびFACの添加によって蛍光シグナルの増加がみられたことから、ヘム原料の添加で細胞内遊離ヘムの量が増加したことが観察された。この蛍光シグナル増加はSAの添加で抑えられたことから、SAによってヘムの生合成が阻害されたことが示唆された。さらにZnPPIXの添加で蛍光シグナルはより強くなったことから、ヘムの分解が阻害され、細胞内遊離ヘムの量が増加したことが示唆された。

ヘムタンパク質を一酸化窒素で処理するとヘムが遊離することが知られている。HeLa細胞に一酸化窒素ドナーであるNOC-5を添加し20分間培養した。さらにHemeGREEN™で30分間細胞を処理したのち、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光像を観察し、一酸化窒素が細胞内遊離ヘム濃度に与える影響を評価した。NOC-5の濃度依存的に蛍光シグナルの増加が見られたことから、一酸化窒素によって細胞内遊離ヘム濃度量が増加したことが観察された。