生細胞の小胞体を赤色蛍光で観察できるライブセルイメージング用ERプローブ BrightER

A1. BrightERによる小胞体（ER）の特異的標識は偶然発見されたものであり、正確な標識機構や、BrightERが結合するER内の標的分子は現時点では明らかになっていません。
化学構造から、脂質ではなくタンパク質を標的としている可能性が高いと考えられています。そのため、多くの他社ERプローブで見られる、細胞膜成分などの脂質性構造への非特異的結合のリスクを低減できると考えられています。

A2. BrightERのERへの特異性は、共局在解析により確認されています。BrightERの蛍光シグナルは、Transferrin Receptor（TfR）の蛍光シグナルと高い相関を示しています。詳細はメーカーWebサイトのResultsセクションの「BrightER does not affect intracellular protein trafficking in breast cancer cells」をご確認下さい。

A3. BrightERは、生細胞における小胞体（ER）のライブイメージングに使用できます。良好な観察結果を得るためには、落射蛍光顕微鏡よりも、高倍率の共焦点顕微鏡の使用が推奨されています。
また、BrightERはフローサイトメトリーにも使用できます。Thapsigargin処理により、BrightERシグナルが濃度依存的に増加することが確認されており、簡便かつ信頼性の高いERストレスマーカーとして利用できる可能性が示されています。さらに、他の研究グループでは、誘導性遺伝子ノックダウンに伴うBrightERシグナルの変化を測定することで、ER局在タンパク質の機能解析に使用されています。詳細はメーカーWebサイトのResultsセクションの「RyR activity regulates ER-lysosomal contact site formation via interaction with the lysosomal vATPase」をご確認下さい。

A4. BrightERは、患者由来グリオブラストーマ細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、U-2 OS細胞（ヒト骨肉腫由来細胞株）、SVG-A細胞（ヒトアストロサイト由来細胞株）、SUM159細胞（ヒト乳がん由来細胞株）、B16F10細胞（マウスメラノーマ由来細胞株）、LLC細胞（マウスルイス肺がん由来細胞株）、Vero E6細胞（サル腎上皮由来細胞株）において、ER標識に使用された実績があります。

A5. BrightERを細胞に添加した後、少なくとも3時間は安定したERシグナルが得られることが確認されています。また、この条件では、細胞毒性やERの生理機能への影響は認められていません。

A6. BrightERで標識した細胞を用いた細胞内タンパク質輸送の機能アッセイにより、ERの生理機能への影響が評価されています。その結果、BrightERはERから細胞膜へのタンパク質輸送に影響を与えないことが示されています。詳細はメーカーWebサイトのResultsセクションの「BrightER does not affect intracellular protein trafficking in breast cancer cells」をご確認下さい。

A7. BrightERは生細胞試料専用です。アルデヒド固定後は細胞内に保持されないため、固定細胞には使用できません。

A8. 1バイアルには100 μlの色素溶液が含まれています。培地中で終濃度が1：100希釈となるように使用することを推奨しています。この条件では、1バイアルで最大10 mlのイメージング培地を調製できます。至適使用濃度は、細胞種や用途に応じて調整可能です。一部のユーザーでは、1：1,000まで希釈しても十分な蛍光シグナルが得られています。

A9. BrightERはTetramethylrhodamine色素に由来する蛍光特性を示し、最大励起波長は557 nm、最大蛍光波長は576 nmです。

A10. BrightER溶液中で凝集が生じる場合があります。プロトコルでは、30秒間のボルテックスと70℃で90秒間の加温を2サイクル行うことで、多くの顆粒状物質を溶解できるとされています。
残存する顆粒が問題となる場合は、イメージング培地を除去し、色素を含まない新しい培地に交換して下さい。必要に応じて2～3回洗浄します。また、超音波処理やPluronic F-127の使用により、BrightERの凝集形成を低減できる場合があります。
なお、凝集を除去する目的でチューブを遠心し、上清のみを使用する方法は推奨されていません。この操作により、シグナル強度が低下する可能性があります。

A11. BrightERは強い蛍光を示すローダミン色素で標識されているため、イメージング培地中に残存するBrightER由来のバックグラウンド蛍光が、特に落射蛍光顕微鏡での観察時に問題となる場合があります。バックグラウンド蛍光を低減する方法として、以下が挙げられます。

• フェノールレッド不含培地を使用する。
• BrightERで15分間インキュベートした後、イメージング培地を除去し、色素を含まない新しい培地に交換してから観察する。
• 励起光強度を、観察に必要な最小限の強度に調整する。
• 可能であれば共焦点顕微鏡を使用し、細胞内のBrightERシグナルとバックグラウンド蛍光を分離して観察する。

A12. 推奨プロトコルは多くの細胞種で使用可能であることが確認されていますが、ER標識に最適な実験条件は、細胞種や実験目的によって異なる場合があります。イメージングバッファー、インキュベーション時間、色素濃度などを調整することで、標識条件を最適化できます。
以下の条件での使用例があります。

• イメージングバッファー：細胞培養培地、PBS、HBSS
• インキュベーション時間：最大3時間
• 色素濃度：1：1000～1：100希釈