組織を内外均一に3D染色するキット 3次元組織染色キットCUBIC-HV™

A1. 抗体を用いる場合は、Alexa Fluor色素などで直接蛍光標識した抗体、またはJackson Immunolab社のFabuLight Fab fragment二次抗体の使用を推奨します。Alexa Fluor色素のうち、AF488がCUBIC-Rと適合しないため、代替としてFITCなどをご使用下さい。CUBIC-HVプロトコルでは一般的なIgG型二次抗体の使用は、深部染色性が担保されないため推奨しません。核染色には、ヨウ化プロピジウム（PI）、SYTOX-Green、RedDot2のいずれかを推奨します。

A2. 参考文献中では、透明化前後で抗原性が保たれることを確認しているタンパク質もありますが、すべてのタンパク質について確認していないため、実際にお持ちの抗体でご検討下さい。CUBIC-L処理前後の切片を用いて染色性を比較することで適合性の確認が可能です。

A3. CUBIC-HV™2では、3次元染色の前にFabuLight Fab fragment二次抗体と一次抗体を反応させて複合体を形成します。2次元切片で汎用される2ステップ（一次抗体→二次抗体）の染色は、深部染色性が担保されないため推奨しません。

A4. EGFP、EYFP、Venus、tdTomato、mCherry、mKate2の蛍光シグナルの保持について確認しています。その他の蛍光タンパク質については、事前にご自身でご確認下さい。

A1. CUBIC組織透明化は組織をわずかに膨張させて透明度と顕微鏡解像度を向上させるよう設計されているため、組織よりやや大きい径のチューブやタッパーなどの容器を推奨します。試薬はチューブ容量の半分程度まで入れ、容器を横にしたときに試料が液面から出ない程度が目安です。CUBICの試薬は水系のためポリプロピレンやポリエチレンの容器に入れても安全に使用できることを確認しています。

A2. 個々の細胞が膨潤することはありますが、細胞同士の位置関係は保たれます。ただし、組織によっては剛性の異なる構造（例：神経と血管など）が混在しており、アーティファクトの原因となる場合があります。そのため、ケースバイケースでの確認が必要です。

A3. CUBIC透明化試薬はPFA固定組織に最適化されています。未固定の試料は溶解（lysis）するため、必ず固定操作を行って下さい。

A4. 固定液に長期間（数週間以上）浸漬した試料でも透明化は可能です。ただし、固定条件は透明化に大きく影響するパラメーターであるため、可能な限り固定液の調製条件や固定期間を一定にすることを推奨します。株式会社CUBICStarsが提供するプロトコルでは、実験動物を還流固定した後、24時間以内にPBSで洗浄し、速やかにCUBIC-L処理を開始することを推奨しています。

A5. パラフィン包埋試料は、脱パラフィン処理後に透明化が可能です。詳細な手順については、以下もご参照下さい。
Nojima, S., et al., Sci. Rep., 7(1), 9269(2017). [PMID:28839164]

A6. マウス全身透明化では、全身が十分に浸る量の試薬をご用意下さい。臓器透明化では、チューブ容量の半分程度まで試薬を入れ、チューブを横にした際に臓器全体が浸るチューブサイズと試薬量を選択して下さい。例として、マウス脳の場合は20～30 mlチューブにCUBIC-Lを10～15 ml入れます。使用する試料や容器の大きさによって必要量は変動しますが、目安として、成体マウス1匹の全身透明化では合計でCUBIC-Lが200～400 ml、CUBIC-Rが100～200 ml程度、各臓器（約1 cm³）透明化には合計でCUBIC-Lが20～40 ml、CUBIC-Rが10～20 ml程度必要です。

A7. 以下の理由が考えられます。以下の対処法をご検討下さい。

1. 固定に用いたPFA溶液のpHが高い
   pHが8を超えると過固定となり、臓器が黄色くなり透明化が進みにくくなるため、pHを7～7.5にして下さい。
   またPFA溶液のpHや処理時間によって透明化の程度が変わるため、固定時間や固定液の調製条件は可能な限り一定にすることを推奨します。
2. 脱脂が完了していない
   脱脂工程を延長するか、CUBIC-Lの交換頻度をご検討下さい。2日おきにCUBIC-Lを新鮮なものに交換し、37℃で振とうさせることを推奨します。
3. 透明化が完了していない
   CUBIC-Rに水分が持ち込まれると、試薬の屈折率が低下して透明化が不十分になります。CUBIC-Rを交換して下さい。

A8. 成体マウスの組織の場合、脱脂期間の目安は3～7日間程度です。ただし、臓器によって脱脂に要する期間は異なります。臓器の種類や大きさ、実験目的に応じて脱脂期間を設定して下さい。例えば、ライトシート顕微鏡観察では完全な透明化が必要ですが、2光子顕微鏡による部分的な観察では、より短時間で不完全な透明化でも十分な場合があります。

A1. 所属機関の廃棄物担当者と相談の上、所定の処理方法に従って廃液処理を行って下さい。なお、目安として、実験後の生体試料および浸漬に用いた試薬は医療用廃棄物、感染性廃棄物として処理し、未使用のCUBICは水分を多く含む有機廃液、難燃性廃液として処理します。

A2. 使用後のCUBIC-Rに浸漬した状態で、試料は常温保存が可能です。なお、CUBIC-Rの溶媒である水が蒸発すると試料が固化する可能性があるため、パラフィルムなどで容器を密閉して保存して下さい。また、アガロースゲル中でも常温保存可能で、こちらの方がより安定です。アーカイブ保存を行う場合は、CUBIC-RをPBSで洗浄した後、アジ化ナトリウムなどの防腐剤を添加したPBS中で4℃にて長期保存できます。
【アガロースゲル保存法】
適当なチューブに、透明化に使用したCUBIC-Rへアガロース粉末を最終濃度2%となるように加え、加熱して溶解します。アガロース溶液が冷えて固まる前に透明化試料を入れ、十分に冷却してアガロースゲルを固めます。詳細は以下の論文を参照下さい。
Matsumoto, K., et al., Nat. Protoc., 14(12), 3506-3537(2019). [PMID:31748753]

A3. 透明化組織の観察には、ライトシート顕微鏡（LSFM）や高屈折率に対応する対物レンズを備えた共焦点レーザー顕微鏡（CLSM）、2光子顕微鏡の使用を推奨します。観察時は、試料を観察用封入剤に浸し、封入剤の屈折率に対応した対物レンズを用いて観察して下さい。近年では、透明化組織観察用の安価なライトシート顕微鏡も開発されています。
参考文献：Otomo, K., et al., Nat. Commun., 15(1), 4941(2024). [PMID:38866781]

A4. CUBIC-Rの屈折率（RI）は1.522です。屈折率を変化させる可能性があるため、CUBIC-Rに水などの溶媒を混合することは避けて下さい。

A5. CUBIC-1（Scal eCUBIC-1, Reagent-1）、CUBIC-2（Scal eCUBIC-2, Reagent-2）とCUBIC-L、CUBIC-Rは別の試薬です。CUBIC-1およびCUBIC-2はCUBICの第一世代にあたり、これを改良した第二世代のCUBICがCUBIC-LおよびCUBIC-Rです。第二世代では透明度が飛躍的に向上しています。機能として、CUBIC-1はCUBIC-Lと同様に脱脂、脱色作用を示し、CUBIC-2はCUBIC-Rと同様に屈折率調整作用を示します。