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オルガノイド染色用の抗体浸透ブースター OmniStain for Organoid

掲載日情報：2025/10/24 現在Webページ番号：72549

イルモス /
Illumos Ltd
[メーカー略称：ILM]

オルガノイド用の三次元（3D）組織染色用キットです。特別な装置や複雑な前処理を必要とせず、オルガノイド深部まで抗体を浸透させ、均一な染色を実現します。染色は24時間以内に完了し、96ウェルプレートを用いたハイスループット処理にも対応可能です。各種組織透明化法と組み合わせることで、オルガノイド解析を強力にサポートします。

※ 全脳など組織用の製品はこちらをご確認下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


従来法による染色（左）と本製品を用いた染色（右）の比較
同一抗体を用いて従来法（一般的な免疫染色）と本製品を用いて肺オルガノイドを染色した。
従来法では、オルガノイド深部のシグナルは弱く、主に表層のみ染まっている（動画中の左側） が、本製品を用いるとオルガノイド深部まで均一に染色されていることがわかる（動画中の右側）。


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三次元（3D）組織染色について

三次元（3D）組織染色とその課題

近年の組織透明化技術とライトシート顕微鏡技術の進歩により、動物の個体やヒト臓器の内部構造を三次元的に観察できるようになり、二次元（2D）断面では確認できなかった細胞や組織の立体構造、細胞間の繋がりなどの空間的な情報をより正確に捉えることが可能になりました。また、3D組織観察は、組織切片の作製時間の節約、切片作製に伴う物理的な変形や試料損失の防止などのメリットももたらします。しかし、3D組織を「観察」する技術や方法は確立されつつありますが、3D組織の「染色」には課題が残されていました。

3D組織染色における大きな課題は、染色用の抗体やプローブが組織表層の抗原などに優先的に捕捉されてしまうため、浸透および染色が表層から数百マイクロメートルまでの間に限られてしまう点です（下図）。それらを均一に組織深部まで浸透させるには、複雑な操作や高価な装置、過剰な透過処理、大量の抗体やプローブ、数週間に及ぶインキュベーション時間と労力があれば達成可能ですが、3D組織染色および解析を行う上で大きな障壁となっていました。

三次元（3D）組織染色と課題


これまで、この3D組織染色の課題に対してさまざまな解決方法が試されてきました。そのひとつであるSWITCH法は、組織透過剤でもあるSDSのAb（抗体）-Ag（抗原）結合阻害特性を利用した組織深部ラベリング法です。SDSを含む溶液で平衡化した組織において、抗体は抗原との結合が阻害され組織深部まで拡散します。次いでSDSを含まない溶液で組織をインキュベーションすることで抗体の抗原への結合が回復し、組織深部染色が可能になります。
しかし、SWITCH法による組織深部染色は、限られた抗原でのみ検証されており、汎用性に欠けます。これは、SDSによる抗体の変性、抗体の結合反応の回復の点が問題であると考えられています。

Illumos社のOmniStain Kitについて

これまでの3D組織染色（組織の深部染色）の課題を解決するための方法として、Dr. Hei Ming LAI（香港中文大学）によりIn situ Host-Guest Chemistry for Three-dimensional Histology（INSIHGT）法が開発され、彼らが設立したIllumos社よりOmniStain Kitとして販売されています。

INSIHGT法は、SWITCH法におけるSDSの代わりにSodium Dodecahydro-closo-dodecaborate：Na2[B12H12]を使用し、Na2[B12H12]をトラップするための化合物としてシクロデキストリンを使用します。同法では、Na2[B12H12]によって抗体の抗原への結合を阻害し、抗体を組織深部まで拡散させます。次いでシクロデキストリンを組織に浸透させることでNa2[B12H12]と錯体を形成し、抗体－抗原反応が回復=抗体の深部浸透／染色を可能にします。

OmniStain Kitの概略

OmniStain Kitの概略


参考文献

  • Yau, C.N., et al., "INSIHGT: an accessible multi-scale, multi-modal 3D spatial biology platform.", Nat. Commun., 15(1), 10888 (2024). [PMID：39738072]
  • Yau, C.N., et al., "Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology.", Cell Rep. Methods, 3(5), 100458 (2023). [PMID：37323568]

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特長

  • 高い浸透性と均一な染色
    従来の2D染色法に比べ、抗体の浸透性・均一性が20～30倍向上します。
  • 短い染色時間
    24時間以内に染色が完了します（～2 mmサイズのオルガノイド）。
  • 幅広い抗体適合性
    360種類以上の市販抗体で適合性を確認済みです。検証した抗体リストはこちらからご覧下さい。
  • 一次抗体の蛍光標識が不要
  • 各種透明化法との適合
    主要な透明化試薬と併用できます。
    検証済みの透明化試薬：BABB、DISCO family clearing、ECi、CUBIC、SHIELD、CLARITY、OPTIClear、FOCM、FRUIT、SeeDB、ScaleS

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使用例

OmniStain for Organoidを用いた染色例です。クリックすると動画が再生します。

3D brain organoid

Skin hair follicle organoid


Skin hair follicle organoid

Skin hair follicle organoid


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操作方法概略

本プロトコルは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ポリエポキシド固定処理したオルガノイド用です。特に記載がない限り、すべてのステップを20～25℃で行って下さい。
※ 以下の記載は、参考用のものとなります。詳細は価格表に掲載されたデータシートをご確認下さい。

オルガノイド前処理・染色・透明化（クリックで開閉します）

前処理

  1. 各オルガノイドの製造元から推奨されている回収溶液を用いて、Matrigelからオルガノイドを慎重に単離する。
  2. 先端をカットしたパスツールピペットを使用してオルガノイドを回収し、マイクロチューブまたはポリプロピレン製の96ウェルプレートへ移す。
  3. 固定したオルガノイドを50%v/vメタノール、続いて100%メタノール×3回（各10分）で脱水する。
  4. オルガノイドをCH2Cl2/メタノール（2:1 v/v）混合液（脱脂用溶液）に1時間浸す。
    ※ 溶液はドラフト内で混合・添加すること。
  5. オルガノイドを100%メタノール×3回、50%メタノール/H2O、PBSN（1×PBS＋0.5% w/v アジ化ナトリウム）×2回（各10分）で洗浄する。
  6. オルガノイドを1×OmniStain Buffer A（100 μl）で37℃、1時間プレインキュベートする。
    ※ 1×OmniStain Buffer Aは、2×OmniStain Buffer AとPBSNを等量混合して調製する。

OmniStaining

  1. 以下に従って、染色液を調製する。
    染色液の調製
  2. プレインキュベーションで使用した1×OmniStain Buffer Aを除去・廃棄する。各オルガノイド試料に100 μlの染色溶液を加える。20～25℃で一晩、暗所で穏やかに振とうさせながらインキュベートする。

洗浄および透明化

  1. オルガノイドを500 μlの1×OmniStain Buffer Bで1時間×2回、20～25℃で洗浄する。十分に洗浄されるよう、チューブを水平にし、振とうする。
  2. オルガノイドをPBSNで20～25℃、15分×3回しっかりと洗浄する。十分な洗浄を行うため、チューブを水平にし、振とうする。
  3. オルガノイドをステップ3と同様に段階的に脱水し、最終的に100%メタノールへと移行する。
    ※ ステップ3：50%v/vメタノール／水で脱水し（10分）、その後100%メタノールで10分×3回処理する。
  4. 先端をカットしたパスツールピペットを用いて、オルガノイドを慎重に回収し、共焦点観察用ディッシュのカバーガラス上に移す。オルガノイド周囲のメタノールをすべて除去し、オルガノイドにBABB、DBEまたはECiを少量滴下し、振とうせずにインキュベートする。オルガノイドは約1時間以内に透明化され、イメージング可能な状態となる。

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キット内容

  • 2× OmniStain buffer A
  • 1× OmniStain buffer B
  • 1× OmniStain buffer C

※ 1キットで最大50個のオルガノイドに使用可能です。
※ 本製品は、最大2 mm×2 mm×2 mmサイズのオルガノイド用です。それ以上のサイズの試料には通常のOmniStainキットをご利用下さい。
※ 別途必要な試薬および機器については、操作方法概略の各プロトコルをご確認下さい。

OmniStain for Organoidの外観

透明化試薬

Illumos社では、以下の有機溶媒系透明化試薬を推奨しています。
ベンジルアルコール／ベンジル安息香酸エステル混合液（1:2 v/v、BABB）＊1、ジベンジルエーテル（DBE）、シンナム酸エチル（ECi）
＊1 BABBは別売品として販売しています。詳細はこちらをご確認下さい。


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使用する抗体についてのFAQ

Q1. OmniStainでは、蛍光標識済みの一次抗体が必要ですか？

A1. 必要ありません。本キットのプロトコルでは二次抗体としてFabフラグメント（蛍光標識）を推奨しており、市販の一次抗体（IgG分子）と同時にインキュベートでき、抗体の凝集はおこりません。Illumos社では、Jackson Immunoresearch社の蛍光色素標識二次抗体：Fabフラグメントを推奨しています。

Q2. Fabフラグメントを用いる利点は何ですか？

A2. 二次抗体としてIgGを用いる場合は、一次抗体を凝集させてしまうため＊2、組織への添加は別々に行い、また間に十分な洗浄が必要です。一方、二次抗体としてFabフラグメントを用いる場合、一次抗体と同時に添加できるので、1ステップで間接免疫蛍光染色が可能です。すなわち実験工程を2ステップ省き、3D免疫染色の時間を半分に短縮できます。

＊2 Fabフラグメントは1価であり1つの抗原に結合します。一方、IgGは2価であり2つの抗原に結合します。抗原に2つの結合部位がある場合、IgGを用いると凝集する可能性がありますが、Fabフラグメントではそのような心配はありません。

Q3. 1つの一次抗体に対してFabフラグメントは何個結合しますか？

A3. 平均で3個です。Fabフラグメントはポリクローナルであるため、各一次抗体IgG分子上のランダムな部位に結合します。

Q4. OmniStain以外の染色法においてもFabフラグメントによって免疫染色を簡略化できますか？

A4. 理論的には可能です。これはFabフラグメントを用いると凝集を起こさないためです。しかし、OmniStainキットを使用しない場合、Fabフラグメントは一次抗体のIgG分子と事前に複合体を形成してしまいます。この結果、複合体のサイズは約300 kDaとなり、150 kDaのIgG分子単独と比べて同じ距離を拡散するのに1.41倍の時間が必要になります。
例えば、iDISCO+の場合、成体マウス全脳の染色には一次抗体で7日間、二次抗体で7日間、合計14日かかります。Fabフラグメントを使うと一次抗体と同時に添加できますが、必要な染色時間は7×1.41≈10日かかり、また、浸透が不均一になる可能性があります。これに対して、OmniStainキットを使用すると、一次抗体（IgG）と二次抗体（Fabフラグメント）は乖離した状態を保ちます。そのため、組織に浸透する分子の最大サイズは150 kDaに保たれます。また、OmniStainの特殊な化学的性質により、免疫染色の所要時間を3日に短縮でき、さらに浸透の均一性も向上します。

Q5. Fabフラグメントの代わりにナノボディは使えますか？

A5. 使えます。ナノボディ（VHH抗体、シングルドメイン抗体とも呼ばれる）は、アルパカやラマ由来の抗体で、Fabフラグメントと同様に一価です。

Q6. ナノボディよりもFabフラグメントを推奨しているのはなぜですか？

A6. Fabフラグメントはシグナル増幅に優れているためです＊3。また、OmniStainを使用する場合、ナノボディのサイズが小さいことによる利点はごくわずかです＊4。

＊3 通常、ナノボディはその小ささゆえに1分子あたり1～3個の蛍光色素しか結合できませんが、Fabフラグメントには9～12個の蛍光色素を標識することができます。さらに、ナノボディはモノクローナル抗体であるため、一次抗体IgG分子の2か所にしか結合できません。一方、Fabフラグメントはポリクローナルであり、平均して1つの一次抗体に3個結合します。したがって、各抗原に対しての最大シグナル増幅は以下のとおりです。
・ ナノボディの場合：2×3＝6倍
・ Fabフラグメントの場合：3×12＝36倍
標的部位の異なるナノボディを併用することでシグナルを倍増できますが、こうしたナノボディは入手が難しく、コストも2倍になります。

＊4 ナノボディは小型（約14 kDa）で、理論的にはより深くまで浸透できる可能性があります。しかし3D免疫染色では、浸透の深さや染色の均一性は拡散速度が遅いことによって制限されるわけではなく、組織表面の抗原により抗体が消費されてしまうことが主な問題です。つまり、OmniStainを使用せずに、ナノボディ単体で浸透の深さを向上させることはできません。OmniStainを使用すると、ナノボディは浸透深度をおよそ2～3倍向上させることができます。しかし、Fabフラグメントに比べてシグナル強度は低下し、また、ナノボディでなくとも浸透深度を10～20倍改善できるOmniStain単体の効果と比べると、わずかな差にすぎません。

Q7. 多重染色の方法を教えて下さい。

A7. Fabフラグメントは、IgGのFc領域の特定サブクラス（例：IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）に特異的なものを選ぶことができます。これにより、間接免疫蛍光法での多重染色（マルチプレックス化）が容易になります。
Anti-IgG1 Fc特異的FabフラグメントはIgG2a抗体には結合せず、その逆も同様です。よって、異なる抗体のシグナルが混ざらないようにできます。
■ 応用例（4種類の一次抗体と異なるチャンネル）
一次抗体：
・ マウスIgG1抗体（ターゲット：p53）
・ マウスIgG2a抗体（ターゲット：Ki67）
・ マウスIgG2b抗体（ターゲット：keratin 7）
・ マウスIgG3抗体（ターゲット：somatostatin）

以下のようにFc特異的Fabフラグメントを使うと、すべて異なる蛍光チャンネルで検出できます。
・ Goat anti-Mouse IgG1 Fc（Alexa Fluor 488）→ p53
・ Goat anti-Mouse IgG2a Fc（Alexa Fluor 594）→ Ki67
・ Goat anti-Mouse IgG2b Fc（Alexa Fluor 647）→ Keratin 7
・ Goat anti-Mouse IgG2c Fc（Alexa Fluor 680）→ Somatostatin

Q8. OmniStainへ適用できる一次抗体（IgG）－二次抗体（Fab）ペアの最大数を教えて下さい。

A8. 理論的には利用できる一次抗体の種類に制限されます。例として、8プレックス実験例を次に示します。
■ 一次抗体
・ マウスIgG1抗NeuN抗体
・ マウスIgG2a抗MAP2抗体
・ ラットIgG1抗神経neurofilament抗体
・ ラットIgG2a抗GFAP抗体
・ ウサギ抗ALDH1L1抗体
・ モルモット抗TMEM119抗体
・ ニワトリ抗CNP1抗体
・ ヤギ抗CD31抗体
・ DAPI / INSIGHT buffer C（核染色）

■ 二次抗体（Fabフラグメント）
・ ヤギ抗マウスIgG1 Fc特異的Fabフラグメント、Atto 430LS-conjugated
・ ヤギ抗マウスIgG2a Fc特異的Fabフラグメント、Atto 490LS-conjugated
・ ヤギ抗ラットIgG1 Fc特異的Fabフラグメント、Alexa Fluor 488-conjugated
・ ヤギ抗ラットIgG2a Fc特異的Fabフラグメント、BODIPY 581/591-conjugated
・ ロバ抗ウサギFabフラグメント、BODIPY-TMR-conjugated
・ ヤギ抗モルモットFabフラグメント、Alexa Fluor 610-conjugated
・ ヤギ抗ニワトリFabフラグメント、Alexa Fluor 647-conjugated
・ ウシ抗ヤギFc特異的Fabフラグメント、Alexa Fluor 680-conjugated

※ 最下段、抗ヤギFabフラグメントはFc特異的である必要があります。Fc特異的でない場合、他のヤギ由来Fabフラグメントと交差反応を起こします。

Q9. OmniStainで使える抗体の検証方法を教えて下さい。

A9. 以下（メーカーウェブ）を参考にして検証して下さい。
・ How To Test Your Antibodies（Ⅰ）
・ How To Test Your Antibodies（Ⅱ）


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オルガノイド用の抗体染色試薬。ブロッキングを必要とせず、オルガノイド深部まで抗体を均一に浸透させます。オルガノイド50個分の試薬が含まれます。
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有機溶媒系の透明化試薬。ベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジルの混合物（BABB）。OmniStainで染色した三次元組織の透明化で推奨。
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説明文 有機溶媒系の透明化試薬。ベンジルアルコールおよび安息香酸ベンジルの混合物（BABB）。OmniStainで染色した三次元組織の透明化で推奨。
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