Salimetrics社 唾液採取ハンドブック

唾液試料は、簡便で、侵襲性が低く、繰り返し採取できます。唾液は複雑で不均一な生体試料であるため、適切に採取しないとデータエラーにつながる可能性があります。ただし、適切な唾液採取および取り扱い手順に従うことで、この種の試料から高品質で再現性のあるデータを取得できます。研究者が唾液試料の完全性を最大限に高めることを支援するために、次のアドバイスを提供します。

1. 唾液試料の測定に関する知識は急速に増加し、改訂されています。Salimetrics社の技術チームは、唾液のバイオサイエンスをサポートするという使命の一環として、最新情報を維持し、技術サポートを行っています。
2. 測定対象に関する文献を参照することをお勧めします。入手可能な文献が不十分と思われる場合は、予備検討の実施を強くお勧めします。特定の研究に使用する最良の方法を決定するのは、最終的には各研究者の責任です。追加の議論や最新情報については、The Salivary Bioscience Bulletinに登録することをお勧めします。

唾液成分の変動

唾液中の多くの分析対象物の濃度は一定ではなく、さまざまな影響に応じて変化することがあります^1～5。試料は個人間でも大幅に異なる場合があります。関心のある分析対象物と研究の性質に応じて、いくつかの要因が重要になる場合があります。

• 採取時間：ほとんどのホルモンは発現に日内変動を示しており、これは特定の唾液タンパク質にも当てはまります。コルチゾールに基づく研究は、特に昼夜サイクルを通じてコルチゾール発現リズムの影響を受け、コルチゾールの日周発現に特化した研究が研究設計の中心となります。分析対象に基づく具体的な推奨事項については、文献を参照、または当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問合せ下さい。ほとんどの研究では、測定意義を最大化するために、試料採取は特定の時間または一定期間内に行う必要があります。

ⓘ	希望の試料採取間隔が遵守されているか評価できるように、可能な限り採取時間を正確に記録する必要があります。

• 反応と回復特性：研究に介入やストレス要因が関連する場合、試料採取は、反応を適切に捉えられるようにタイミングを計る必要があります。これは、数か月にわたる長期間隔の研究や、ストレス反応を測定する実験室ベースのストレス反応の研究に当てはまります。

口腔内の位置による影響（スワブ法のみ）

流速の影響

試料量と唾液分泌刺激物質

唾液分析とDNA解析の組み合わせ

唾液への血液混入

唾液採取器具の検討

測定対象物質の完全性の維持

試料を採取する前に、基本的な分析対象の安定性を調べ、保管に関する推奨事項に従うことが重要です。試料を保管するには、高品質なポリプロピレン製の採取器具とバイアルのみを使用して下さい。ポリスチレンやその他の検証されていないプラスチック製の器具は、分析対象の測定値に悪影響を与える恐れがあります。Salimetrics社の採取器具とバイアルはすべて高品質のポリプロピレンで作られています。
Salimetrics社では、すべての試料を採取後すぐに凍結することを推奨しています。これが不可能な場合は、以下のことを考慮する必要があります。

• 不安定な分析対象物の中には室温で急速に変化するものもあります（ペプチドやタンパク質など）。
• DHEA、プロゲステロン、エストラジオールなどの一部の分析対象物については、凍結融解の繰り返しを最小限に抑える必要があります。

3つの異なる温度で96時間保存した場合の唾液エストラジオール濃度への影響（n=10）。

ⓘ	生体試料の種類にかかわらず、凍結融解はほとんどの生物学的測定に劇的な影響を及ぼす恐れがあります。原則として、複数回の凍結融解は避けるべきです。複数の分析対象を測定する場合、最も実用的な対処方法は、採取後すぐに試料を分注することです。唾液は粘性が高いため、これは難しい工程になる可能性があり、試料の分注によって分析対象の値がわずかに変わってしまう場合がありますが、凍結融解の劇的な影響を回避するには有益です。1回凍結融解した後に遠心分離して分注すると、粘性が低く、ピペッティングしやすい液体になり、より再現性が高く分注できるようになります。

1. 唾液を適切に採取するには、結果に影響を与える可能性のある項目を記録し、イムノアッセイに干渉する可能性のある物質によって唾液が汚染される可能性を避けるため以下のような手順に従う必要があります。
   1. 唾液試料採取直前には糖分や酸性度の高い食品、カフェイン含有量の多い食品の摂取は避けて下さい。これらは、唾液のpHを下げて細菌の増殖を促進し、測定結果に悪影響を及ぼす可能性があります^13、14。
   2. 過去12時間以内のアルコール、カフェイン、ニコチン、処方薬／市販薬の摂取は記録して下さい^15～18。
   3. 激しい身体活動と口腔内の傷や疾患の存在も記録してして下さい^19、20。
   4. 試料採取前の60分以内はメインの食事を避け、30分以内は一切の食物の摂取を避けて下さい。
   5. 口腔内の食物残渣を取り除くために水で口をすすいで下さい。試料の希釈を避けるためにすすいでから唾液を採取するまで少なくとも10分間待って下さい。

• 流涎：ほとんどの研究者は、採取された試料の種類の一貫性を維持するために、流涎により採取された刺激されていない全唾液を使用することを好みます。
• スワブによる唾液採取：スワブを口の中に入れて唾液を採取できるので、使いやすさが向上します。小さな児童や流涎による唾液採取が困難な人を対象とした研究では、実験参加者に適したスワブを用いた採取が必要になる場合もあります。ただし、スワブを使用できる分析対象は限定されます。Salimetrics社のスワブはすべて、同様に、無毒で不活性なポリマーで作られており、すべてのロットで一貫性が確認されているため、長期的および複数の実験参加者によるグループ研究に最適です。

• 適切な唾液採取方法を選択する前に、次の基準を考慮して下さい。
  • 実験参加者の年齢と動物種
  • 目的の分析対象について検証済みかどうか
  • 必要な試料数
  • 必要な試料量
  • 分析対象が単一もしくは複数かどうか。DNA分析を実施するかどうか。
  • 実験参加者自身で唾液を採取するか、もしくは補助が必要かどうか。
  • バイオバンクへの寄託と試料の廃棄
• 唾液採取の案内動画はこちらからご確認下さい。

流涎による唾液採取

Salimetrics Oral Swab（SOS）

採取器具を口に入れると窒息する可能性があるため、乳児や6歳未満の児童から唾液を採取する場合は特別な配慮が必要です。

Salimetrics Children's Swab（SCS）とSalimetrics Infant's Swab（SIS）

唾液中のバイオマーカーは、動物の健康や幸福度のモニタリングにますます利用されるようになっています（例：犬の唾液コルチゾールとストレス）。この技術は、多くの生物行動学的研究において、研究者に有効で一貫性や再現性のある結論を得る機会を継続的に提供しています。コットンロープ、コットンスワブ、パッド、Salivettes、水和セルローススポンジなどの器具が、シカ、モルモット、イヌ、ウマ、霊長類、その他の動物種から唾液を採取するといった最初の技術として使用されました^19～36。しかし、最新の唾液採取デバイス技術と採取プロトコルにより、以前の採取方法での負担が大幅に軽減されました。
Salimetrics社では、快適で安全な唾液採取を実現するために、直径8 mm以上の口を持つ動物から唾液を採取するための検証済みの方法として、Salimetrics Infant's SwabおよびSalimetrics Children's Swabを推奨しています。

• 動物の唾液採取におけるSalimetrics社スワブの利点：
  • 快適で無毒に採取可能
  • 破れや裂けに強い
  • 毛細管現象により迅速に採取可能
  • 容量1～2 ml（器具によって異なります）
  • 窒息の危険なし（実験者が安全に保持している場合）

• 動物からの唾液採取を成功させるためのヒント：
  • 唾液をゆすがせようとするのではなく、唾液が溜まっている部分にスワブを「軽く当てる」
  • 採取前に動物を訓練し、スワブをゆっくりと挿入する
  • 非家畜動物の唾液採取には、「届く範囲が広い」器具（ポール、棒など）がよく使用される

小動物：文献には、毛細管、ろ紙片、プラスチックピペットなど、より高度な吸引装置などによるマウスやラットからの唾液採取のさまざまな技術が記載されています。ただし、Salimetrics社では、このような方法を直接使用した経験がないため、それらの使用についてアドバイスすることはできません。
唾液バイオサイエンスを非ヒト科学研究に統合する研究に関連する方法の完全な概要については、「Advancing the social neuroscience of Human-Animal Interaction: The Role of Salivary Bioscience」（第9章）を参照して下さい。

採取方法と試料量

唾液DNAの安定性

唾液DNA試料の保存

試料の汚染防止

採取後すぐに試料を－20℃（家庭用冷凍庫の温度）以下で凍結して下さい。

Salimetrics Swabによる採取：試料はスワブ内で最大6か月間凍結することができ、分析対象物の劣化はありません。6か月間の保存期間中に起こり得る唯一のリスクは試料の蒸発ですが、分析対象自体は劣化しないはずです。ただし、試料を6か月以上保存する必要があることが事前にわかっている場合は、採取後すぐに遠心分離またはシリンジでスワブから唾液を絞り出し、回収した唾液をクライオバイアルに移して－80℃で保存することをお勧めします。

試料は、－80℃で数年間保存可能ですが、正確な保存期間は定まっておらず、分析対象によって異なる場合があります。ただし、4年以上適切に保存された試料の多くは、劣化がほとんど見られません。詳細については文献を参照するか、当社テクニカルサポート（試薬担当）までお問い合わせ下さい。

試料を分析する際は試料を室温に戻してボルテックスし、1,500×gで15分間遠心分離します。試料に粘性があるように見える場合は、2,500×gなどの高速で遠心分離するか、ピペットチップで凝血塊を砕いて再度遠心分離します。分析は透明な唾液のみを使用して行い、バイアルの底に形成されたペレットは避けて下さい。唾液などの粘性溶液をピペッティングする場合は、泡の形成を避けるためにゆっくりと吸引すると精度が向上します。再凍結時に沈殿物が発生する可能性があるため、凍結融解サイクルのたびにチューブをボルテックスして再度遠心分離します。

1. West, C. D., et al., "Simultaneous measurement of multiple plasma steroids by radioimmunoassay demonstrating episodic secretion.", J. Clin. Endocrinol. Metab., 36(6), 1230-1236(1973). [PMID:4706210]
2. Dorn, L. D., et al., "Salivary cortisol reflects serum cortisol: Analysis of circadian profiles.", Ann. Clin. Biochem., 44(pt3), 281-284(2007). [PMID:17456296]
3. Nater, U. M., et al., "Determinants of the diurnal course of salivary alpha-amylase.", Psychoneuroendocrinology, 32(4), 392-401(2007). [PMID:17418498]
4. Krieger, D. T., "Rhythms of ACTH and corticosteroid secretion in health and disease and their experimental modification.", J. Steroid Biochem., 6(5), 758-791(1975). [PMID:171514]
5. Rohleder, N. & Nater, U. M., "Determinants of salivary α-amylase in humans and methodological considerations.", Psychoneuroendocrinology, 34(4), 469-485(2009). [PMID:19155141]
6. Beltzer, E. K., et al., "Salivary flow and alpha-amylase: Collection technique, duration, and oral fluid type.", Physiol. Behav., 101(2), 289-296(2010). [PMID:20515701]
7. Crawford, J. M., et al., "Minor salivary glands as a major source of secretory immunoglobin A in the human oral cavity.", Science, 190(4220), 1206-1209(1975). [PMID:1198107]
8. Veerman, E. C., et al., "Human glandular salivas: Their separate collection and analysis.", Eur. J. Oral Sci., 104(4), 346-352(1996). [PMID:8930581]
9. Kugler, J., "Secretion of salivary immunoglobulin A in relation to age, saliva flow, mood states, secretion of albumin, cortisol, and catecholamines in saliva.", J. Clin. Immunol., 12(1), 45-49(1992). [PMID:1551941]
10. Vining, R. F., et al., "Hormones in saliva: Mode of entry and consequent implications for clinical interpretation.", Clin. Chem., 29(10), 1752-1756(1983). [PMID:6225566]
11. Granger, D. A., et al., "Integration of salivary biomarkers into developmental and behaviorally-oriented research: Problems and solutions for collecting specimens.", Physiol. Behav., 92(4), 583-590(2007). [PMID:17572453]
12. Talge, N. M., et al., "It’s not that bad: Error introduced by oral stimulants in salivary cortisol research.", Dev. Psychobiol., 47(4), 369-376(2005). [PMID:16284967]
13. Klein, L. C., et al., "Caffeine and stress alter salivary alpha-amylase activity in young men.", Hum. Psychopharmacol., 25(5), 359-367(2010). [PMID:20589924]
14. Schwartz, E. B., et al., "Assessing salivary cortisol in studies of child development.", Child Dev., 69(6), 1503-1513(1998). [PMID:9914636]
15. Granger, D. A., et al., "Individual differences in salivary cortisol and α-amylase in mothers and their infants: Relation to tobacco smoke exposure.", Dev. Psychobiol., 49(7), 692-701(2007). [PMID:17943979]
16. Hibel, L. C., et al., "Salivary biomarker levels and diurnal variation: Associations with medications prescribed to control children’s problem behavior.", Child Dev., 78(3), 927-937(2007). [PMID:17517013]
17. Granger, D. A., et al., "Medication effects on salivary cortisol: Tactics and strategy to minimize impact in behavioral and developmental science.", Psychoneuroendocrinology, 34(10), 1437-1448(2009). [PMID:19632788]
18. Hibel, L. C., et al., "Individual differences in salivary cortisol: Effects of common over the counter and prescription medications in infants and their mothers.", Horm. Behav., 50(2), 293-300(2006). [PMID:16682032]
19. Kivlighan, K. T. & Granger, D. A., "Salivary α-amylase response to competition: Relation to gender, previous experience, and attitudes.", Psychoneuroendocrinology, 31(6), 703-714(2006). [PMID:16624493]
20. Henskens, Y. M., et al., "Protein composition of whole and parotid saliva in healthy and periodontitis subjects: Determination of cystatins, albumin, amylase and IgA.", J. Periodont Res., 31(1), 57-65(1996). [PMID:8636877]
21. Schwartz, E. B. & Granger, D. A., "Transferrin enzyme immunoassay for quantitative monitoring of blood contamination in saliva.", Clin. Chem., 50(3), 654-656(2004). [PMID:14981036]
22. Kivlighan, K. T., et al., "Quantifying blood leakage into the oral mucosa and its effects on the measurement of cortisol, dehydroepiandrosterone, and testosterone in saliva.", Horm. Behav., 46(1), 39-46(2004). [PMID:15215040]
23. Kivlighan, K. T., et al., "Blood contamination and the measurement of salivary progesterone and estradiol.", Horm. Behav., 47(3), 367-370(2005). [PMID:15708767]
24. Granger, D. A., et al., "Blood contamination in children’s saliva: Prevalence, stability, and impact on the measurement of salivary cortisol, testosterone, and dehydroepiandrosterone.", Psychoneuroendocrinology, 32(6), 724-733(2007). [PMID:17582690]
25. Whembolua, G. L., et al., "Bacteria in the oral mucosa and its effects on the measurement of cortisol, dehydroepiandrosterone, and testosterone in saliva.", Horm. Behav., 49(4), 478-483(2006). [PMID:16309679]
26. de Weerth, C., et al., "A new device for collecting saliva for cortisol determination.", Psychoneuroendocrinology, 32(8-10), 1144-1148(2007). [PMID:17850983]
27. Harmon, A. G., et al., "Measuring salivary cortisol in studies of child development: Watch out--what goes in may not come out of commonly used saliva collection devices.", Dev. Psychobiol., 49(5), 495-500(2007). [PMID:17577235]
28. Shirtcliff, E. A., et al., "Use of salivary biomarkers in biobehavioral research: Cotton based sample collection methods can interfere with salivary immunoassay results.", Psychoneuroendocrinology, 26(2), 165-173(2001). [PMID:11087962]
29. Millspaugh, J. J., et al., "Non invasive techniques for stress assessment in white-tailed deer.", Wildl. Soc. Bull., 30(3), 899-907(2002).
30. Emack, J., et al., "Chronic maternal stress affects growth behavior and hypothalamo-pituitary-adrenal function in juvenile offspring.", Horm. Behav., 54(4), 514-520(2008). [PMID:18674758]
31. Lutz, C. K., et al., "Techniques for collecting saliva from awake, unrestrained adult monkeys for cortisol assay.", Am. J. Primatol., 52(2), 93-99(2000). [PMID:11051444]
32. Newman, J. L., et al., "Social stimuli enhance phencyclidine (PCP) self-administration in rhesus monkeys.", Pharmacol. Biochem. Behav., 87(2), 280-288(2007). [PMID:17560636]
33. Horváth, Z., et al., "Three different coping styles in police dogs exposed to a short-term challenge.", Horm. Behav., 52(5), 621-630(2007). [PMID:17900575]
34. Dreschel, N. A. & Granger, D. A., "Methods of collection for salivary cortisol measurement in dogs.", Horm. Behav., 55(1), 163-168(2009). [PMID:18948108]
35. Dreschel, N. A. & Granger, D. A., "Advancing the social neuroscience of human-animal interaction: The role of salivary bioscience.",The social neuroscience of human-animal interaction,(2016).[DOI:10.1037/14856-012]
36. Gutiérrez, A. M., et al., "C-reactive protein quantification in porcine saliva: A minimally invasive test for pig health monitoring.", Vet. J., 181(3), 261-265(2009). [PMID:18479951]
37. Gómez, A., et al., "Use of salivary steroid analyses to assess ovarian cycles in an Indian rhinoceros at the National Zoological Park.", Zoo Biol., 23(6), 501-512(2004). [DOI:10.1002/zoo.20028]
38. Nemoda, Z., et al., "Assessing genetic polymorphisms using DNA extracted from cells present in saliva samples.", BMC Med. Res. Methodol., 11, 170(2011). [PMID:22182470]
39. Vermeer, H. J., et al., "Downregulation of the immune system in low-quality day care: The case of secretory immunoglobulin A (SIgA) in toddlers.", Physiol. Behav., 105(2), 161-7(2012). [PMID:21878345]
40. Bright, M. A., et al., "Do young children show a cortisol awakening response?", Dev. Psychobiol., 54(7), 736-743(2012). [PMID:22006547]
41. Granger, D. A., et al., "Salivary Bioscience and research on adolescence: A integrated perspective.", J. Adolesc., 35(4), 1081-1095(2012). [PMID:22401843]
42. Out. D., et al., "Disentangling sources of individual differences in diurnal salivary alpha-amylase: Reliability, stability, and sensitivity to context.", Psychoneuroendocrinology, 38(3), 367-375(2013). [PMID:22819683]
43. Geisbrecht, G. F., et al., "Salivary alpha-amylase during pregnancy: Diurnal course and associations with obstetric history, maternal characteristics and mood.", Dev. Psychobiol., 55(2), 156-167(2013). [PMID:22315130]
44. Out, D., et al., "Assessing salivary C-reactive protein: Longitudinal associations with systemic inflammation and cardiovascular disease risk in women exposed to intimate partner violence.", Brain Behav. Immun., 26(4), 543-551(2012). [PMID:22326517]
45. Wilde, C., et al., "Sample collection, including participant preparation and sample handling." The Immunoassay Handbook (Fourth Edition) Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques(2013). [DOI:10.1016/B978-0-08-097037-0.00029-4]